基孔肯雅病毒定量反转录聚合酶链式反应绝对定量检测方法的建立

作者：李春缘; 刘炅; 刘纪茹; 胡潇予; 曹孟涛; 陈月; 田靖; 任瑞文; 徐晓立

来源：中国热带医学, 2022, 1-11.

• 基孔肯雅病毒
• 实时荧光定量RT-PCR
• 快速检测

目的 建立检测基孔肯雅病毒实时荧光定量RTPCR快检方法，为其实验室诊断与定量分析提供技术方法。方法 基于基孔肯雅及其相近虫媒病毒基因组序列的系统比对分析，筛选、鉴定基孔肯雅病毒特异性核酸序列，并以人GAPDH基因为内参照，设计引物、探针，采用L9(34)正交实验确定最佳反应条件，建立基于TaqMan探针法的基孔肯雅病毒qRTPCR快检方法，并详细分析所建立方法的灵敏度、特异性、重复性及覆盖面。以克隆的检测靶标核酸片段为阳性品，制作标准曲线，建立绝对定量方法。结果 经系统优化，建立了基孔肯雅病毒实时荧光定量RTPCR定性、定量检测方法，反应体系包括：基孔肯雅病毒、GAPDH内参照检测引物探针，RT/Taq酶混合液，反应缓冲液，及阴阳性参考品。所建立方法与ECSA亚型ROSS株、IOL分支LR2006株，亚洲型181/25株以及2010东莞流行株均可获得阳性结果，而与所试其它18种黄病毒、甲病毒、布尼安属相近虫媒病毒无交叉反应，检测下限为580拷贝/mL。定量分析表明，在5.80×102～5.80×1010拷贝/mL范围内，检测荧光信号值与模板浓度具备良好线性关系，其R2=0.9995，扩增效率为E=0.91%。重复性实验表明，定量分析的批内变异系数为0.01%～0.07%，批间变异系数为0.03%～0.11%。结论 建立了基孔肯雅病毒的实时荧光定量RT PCR定性、定量快检方法，具备较高的特异性、敏感性与覆盖面，为定性、定量分析提供了新的技术手段。

• 单位
  华南农业大学