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摘要
目的：探讨1,4,5-三磷酸肌醇1型受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1, IP3R1)调控钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)和电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1, VDAC1)在海洛因(heroin, HE)致心肌细胞节律异常中的作用。方法：联合蛋白组学和GEO (Gene Expression Omnibus)数据库分析心律失常芯片数据，寻找关键调控因子。构建IP3R1基因敲减慢病毒并感染原代乳大鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes, NRCMs)，实验分为对照(control)组、HE组和HE+shIP3R1组。结晶紫染色观察心肌细胞形态；ELISA法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)水平；透射电镜观察线粒体形态学变化；Fluo-4/AM探针法检测细胞内Ca2+浓度；DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量；JC-1染色法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)水平；ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平；免疫共沉淀(co-immunopre-cipitation, Co-IP)分析IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1蛋白之间的相互作用；Western blot检测IP3R1、CaMKⅡδ、p-CaM-KⅡδ(T287)和VDAC1的蛋白水平。结果：结合蛋白质组学和基因表达谱数据集GSE89410分析，筛选得到80个差异共表达分子，基于基因本体论(Gene Ontology, GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析结果，最终筛选出关键因子IP3R1，且通过STRING数据库获得IP3R1结合蛋白：CaMKⅡδ和VDAC1。Co-IP结果验证IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1存在相互作用，且HE干预后NRCMs中IP3R1与CaMKⅡδ和VDAC1之间的相互作用增强。体外细胞实验显示，与control组相比，HE组NRCMs数量急剧减少，细胞膜变窄，伪足减少，细胞核结构模糊；LDH和AST水平均显著上升(P<0.05)；线粒体超微结构损伤严重，证实HE对NRCMs具有毒性作用并导致线粒体损伤。与control组相比，HE组心肌细胞内Ca2+浓度、ROS水平、MMP以及IP3R1、p-CaMKⅡδ(T287)和VDAC1蛋白水平均显著升高(P<0.05)，而HE+shIP3R1组这些指标均显著减低(P<0.05);ATP水平则相反。这证实沉默IP3R1表达可减轻HE干预后NRCMs的钙超载及线粒体损伤。结论：IP3R1通过调控CaMKⅡ和VDAC1引起心肌细胞钙超载和ROS生成增多，参与HE诱导的心肌细胞节律异常。
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单位新疆医科大学第一附属医院; 新疆医科大学; 基础医学院
