p65基因序列shRNA慢病毒载体构建及其作用功能的初步研究

作者：黄海; 杜涛; 黄健; 林天歆; 张彩霞; 董文; 尹心宝; 郭正辉; 许可慰; 江春; 韩金利

来源：中华泌尿外科杂志, 2010, 31(6): 386-390.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1000-6702.2010.06.009

• 前列腺肿瘤
• 癌
• 核因子κB

目的 建立稳定阻断前列腺癌细胞株LNCaP中核因子NF-κB(p65)表达的shRNA序列,构建慢病毒载体,检测p65在前列腺癌细胞中的作用功能.方法 根据p65基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3针对p65基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补单链DNA将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中转染前列腺癌细胞,采用RTPCR方法检测不同序列片断对p65 mRNA的抑制效率,免疫印迹方法检测其对p65蛋白表达的抑制效率.将获得的慢病毒载体感染LNCaP细胞,设对照组、空转组.采用MTT、流式细胞术、Transwell等方法检测p65的生物学作用.结果 设计的3条针对p65序列中,第3条序列对前列腺癌细胞株中p65 mRNA的干扰效率为59%,对蛋白表达的抑制率达81%.目的序列位于p65(NM_021975)的1096～1113,茎环序列为5'-GATCC GCCCTATCCCTTTACGTCATTCAAGAGAT-GACGTAAAGGGATAGGGCTTTTTG-3'.转染细胞后,细胞可以稳定低表达p65.MTT检测实验组细胞96 h内未出现对数增殖,生长能力低于对照组和空转组.流式细胞检测实验组G0～G1期细胞百分率为61.49%,高于对照组的44.89%和空转组的41.52%;而S期细胞百分率为28.58%,低于对照组的47.36%和空转组的46.10%,差异有统计学意义(P＜0.05).Transwell检测实验组透过细胞数为(16.5000±6.62076)个,低于对照组和空转组[(45.6333±13.54159)个,(36.8333±5.68412)个],差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功获得稳定阻断前列腺癌细胞株LNCaP中p65表达的shRNA序列,并构建慢病毒载体;初步验证了p65在前列腺癌细胞增殖、侵袭和转移中的促进作用.

• 单位
  中山大学