Met196突变提高Brucella melitensis 7α-羟基类固醇脱氢酶的催化效率和稳定性

作者：柳志永; 张荣珍^*; 徐岩

来源：微生物学报, 2022, 62(05): 1769-1783.

DOI：10.13343/j.cnki.wsxb.20210539

• 羊布鲁氏菌
• 7α-羟基类固醇脱氢酶
• 理性设计
• 催化效率
• 稳定性
• 分子动力学模拟

【目的】通过计算机辅助设计，理性提高羊布鲁氏菌7α-羟基类固醇脱氢酶的催化效率和稳定性，实现酶的高效稳定催化合成。【方法】通过同源建模、分子对接和蛋白-配体相互作用分析，理性设计关键位点的定向突变。结合酶学性质测定、酶促反应动力学分析和圆二色谱测定等实验，测定突变酶的催化功能和稳定性。【结果】与野生型7α-羟基类固醇脱氢酶相比，Met196Ile和Met196Val突变酶的酶活提高了8.33倍和7.41倍，kcat/Km值分别提高了4.93和4.37倍，Tm值分别提高了1.75℃和1.10℃。Met196Ile和Met196Val突变酶催化底物鹅去氧胆酸，合成产物7-氧代-石胆酸所需时间从野生型的8h缩短为2h，最高产率约为91%。通过全原子动力学模拟分析了均方根偏差、均方根波动以及蛋白-配体相互作用，阐明了催化性能提高的分子机制。Met196突变诱导的B环(残基Ala145-Pro157)和α7螺旋(残基Val249-Gly265)的刚性增强有利于提高蛋白的稳定性，底物与结合位点或活性位点(Tyr208、Lys212)相互作用力的增强有利于改善催化效率。【结论】本研究采用同源建模和定点突变改造7α-羟基类固醇脱氢酶的催化活力和稳定性，为工业上高效稳定催化合成7-氧代-石胆酸奠定了较坚实的基础，同时为类固醇脱氢酶的理性设计提供了理论指导。

• 单位
  江南大学; 工业生物技术教育部重点实验室; 生物工程学院