筛选有效抑制血管内皮细胞小窝蛋白-1表达的小干扰RNA及其毒性检测

作者：刘华跃; 嵇富海; 王秀云; 左剑玲; 许期年

来源：国际麻醉学与复苏杂志, 2013, 34(7): 595-599.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4378.2013.07.006

• 血管内皮细胞
• 小窝蛋白-1
• 小干扰RNA
• 磺基罗丹明B法
• 细胞毒性
• 筛选

目的 筛选有效抑制血管内皮细胞小窝蛋白-1(Caveolin-1)表达的小干扰RNA(small interferenceRNA,siRNA)序列,并检测转染复合物的细胞毒性. 方法 设计合成针对Caveolin-1的siRNA 3条(siRNA422,siRNA548,siRNA710)及1条带绿色荧光标记的通用阴性对照FAM-siRNA.在siRNAFect介导下转染血管内皮细胞.用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)测定转染后血管内皮细胞中Caveolin-1 mRNA的表达,Western blot方法测定干扰后Caveolin-1蛋白表达,比较抑制率,筛选出有效抑制Caveolin-1表达的siRNA.采用磺基罗丹明B法(sulforhodamineB,SRB)分析转染复合物的细胞毒性. 结果 ①在siRNAFect相同剂量下,siRNA 20、30 nmol/L组或40 nmol/L组转染效率均达到85％以上(P＜0.01)；②siRNAFect 1.3μl复合10 nmol/L或20 nmol/L siRNA组细胞存活率均达到80％以上(P＜0.05)；③siRNA548对EA.hy926细胞Caveolin-1基因mRNA抑制效果最明显(P＜0.01)；④与阴性对照组及siRNA422、siRNA710相比较,siRNA548干扰血管内皮细胞48 h后,Caveolin-1蛋白的表达量最低(P＜0.01). 结论 ①siRNA548对血管内皮细胞Caveolin-1表达的抑制效果最大.②siRNA浓度20 nmol/L复合siRNAFect 1.3μl转染效率高,细胞毒性低,适合转染.

• 单位
  苏州大学附属第一医院