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摘要
流行病学研究显示牙周病和心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)成正相关,全身灌注牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P. gingivalis)脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)会促进apoE-/-小鼠动脉粥样硬化(artherosclerosis,AS)加重。单核/巨噬细胞吞噬修饰后的脂蛋白形成泡沫细胞是AS的关键事件。为探索牙周病与AS间的相关程度和本质,本研究利用P. gingivalis-LPS对巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中以及形成后表达AS相关基因的影响,从而探讨P. gingivalis-LPS在AS形成中的作用及机制。 第一部分巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立 目的:建立巨噬细胞源性泡沫细胞模型。 方法:使用160nmo1/L PMA刺激THP-1细胞36h使其向巨噬细胞分化后加入含不同浓度oxLDL的培养基分别作用36h和48h,油红O染色观测细胞形态和生化法检测胞内胆固醇变化确认泡沫细胞形成情况。 结果:oxLDL作用48h后胆固醇酯均占细胞内总胆固醇的60%以上,油红O染色显示巨噬细胞内大量的红色脂质颗粒存在,符合泡沫细胞的特征。 结论:PMA诱导THP-1单核细胞形成巨噬细胞后,再加入oxLDL刺激是建立泡沫细胞模型的良好方法。 第二部分P.gingivalis-LPS对oxLDL诱导的泡沫细胞形成过程中表达动脉粥样硬化相关基因的影响 目的:研究P.gingivalis-LPS对oxLDL作用于巨噬细胞形成泡沫细胞过程中AS相关基因和细胞因子的影响。 方法: 1.对细胞因子分泌的影响:ELISA检测RMPI1640、oxLDL和oxLDL+P.gingivalis-LPS刺激的巨噬细胞上清中IL-1β和TNF-α的变化。 2.对NF-κB信号通路的影响: (1)采用免疫细胞化学法检测加入上述刺激后NF-κB p65核转位情况; (2)采用Western blot检测细胞内IκB-α变化。 3.对AS相关基因的影响: (1)采用Real-time PCR技术检测不同刺激对IL-1β、IL-10、IL-12 p40和IL-18等基因转录的变化; (2)使用基因芯片检测与粥样硬化相关的88个基因的变化。 结果: 1.oxLDL和P.gingivalis-LPS具有促进IL-1β和TNF-α分泌的作用,但二者共同刺激没有出现协同作用; 2. NF-κB信号通路的活化情况:免疫细胞化学结果显示oxLDL和P.gingivalis-LPS具有促进NF-κB核转位作用,二者有叠加效应。同时Western blot结果显示oxLDL能降低细胞质内IκB-α水平,加入P.gingivalis-LPS能进一步降低其表达,促进NF-κB的活化; 3. AS相关基因的变化情况:Real-time PCR结果显示oxLDL能促进细胞转录IL-1β、IL-10、IL-12 p40和IL-18,P.gingivalis-LPS能促进这种作用。同时基因芯片结果显示oxLDL单独或者与P.gingivalis-LPS共同刺激可以促进粥样硬化基因芯片88个基因中接近40个基因上调或者下调表达2倍以上。oxLDL上调或下调的基因大多数被P.gingivalis-LPS进一步上调或下调。oxLDL和P.gingivalis-LPS刺激主要影响了大量粘附分子、趋化因子和生长因子以及与凋亡相关基因的转录。 结论:P.gingivalis-LPS能够促进oxLDL诱导的泡沫细胞形成过程中NF-κB信号通路的激活,并主要改变了粘附分子、趋化因子和生长因子以及与凋亡相关基因等AS相关基因的表达。 第三部分P.gingivalis-LPS对oxLDL诱导的泡沫细胞形成后表达动脉粥样硬化相关基因的影响 目的:观察P.gingivalis-LPS对泡沫细胞表达AS基因的影响。 方法: oxLDL作用于巨噬细胞48h使其形成泡沫细胞,然后加入P.gingivalis-LPS。Western blot检测IκB-α含量,Real-time PCR检测IL-1β、IL-10、IL-12 p40和IL-18的转录,基因芯片检测AS相关基因的表达。 结果:P.gingivalis-LPS能降低细胞内IκB-α含量,促进泡沫细胞表达IL-1β和IL-12 p40,能促进泡沫细胞中11个基因进一步上调表达2倍以上。 结论:P.gingivalis-LPS能促进泡沫细胞转录促炎细胞因子,上调多种粥样硬化基因的表达。 第四部分P.gingivalis-LPS对oxLDL诱导的泡沫细胞凋亡的影响 目的:了解P.gingivalis-LPS对泡沫细胞形成过程中以及形成后细胞凋亡及凋亡相关基因的影响。 方法:MTT法检测巨噬细胞受不同刺激后生长活性的变化,AO/EB染色观察细胞凋亡状况,Real-time PCR检测p53、caspase-3和c-Myc基因表达变化,基因芯片技术检测10余种凋亡相关基因的变化。 结果:MTT检测显示oxLDL可以促进细胞存活,P.gingivalis-LPS具有细胞毒性作用,抑制细胞存活;AO/EB染色各组细胞中均有不同程度凋亡出现;在泡沫细胞形成早期,P.gingivalis-LPS能抑制c-Myc的表达,拮抗oxLDL对caspase-3和p53的抑制作用;在泡沫细胞形成后,P.gingivalis-LPS能促进泡沫细胞表达caspase-3,抑制其表达p53。oxLDL和P.gingivalis-LPS能促进基因芯片中多种凋亡基因的转录。 结论:P.gingivalis-LPS对巨噬细胞和泡沫细胞凋亡有广泛影响,可能是P.gingivalis-LPS参与AS形成的重要机制。
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