慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品初步研究

作者：周小雅; 贾芳英; 吴雪伶; 张可华; 孟淑芳^*

来源：中华微生物学和免疫学杂志, 2023, 43(10).

• 慢病毒载体
• 整合位点
• 数字PCR
• 高通量测序
• 光学基因组图谱技术

目的评估8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞作为慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品的可行性。方法选择8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞, 通过有限稀释法挑选单克隆;建立数字PCR法检测8E5细胞内HIV-1的拷贝数和CD19-CAR-Jurkat细胞内CAR的拷贝数;采用高通量测序技术(全基因组重测序法、改良的基因组测序法和探针杂交捕获法)对8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞的整合位点进行检测, 并采用光学基因组图谱技术(optical genome mapping, OGM)对整合位点进行确认。结果经有限稀释法, 挑选出3个8E5细胞克隆和6个CD19-CAR-Jurkat细胞克隆。通过数字PCR及流式细胞术检测基因拷贝数, 确定8E5-D8和CD19-CAR-Jurkat 2-6作为候选细胞, 并扩增冻存。数字PCR检测结果显示, 8E5-D8细胞含有约1拷贝/细胞, CD19-CAR-Jurkat 2-6细胞含有约13拷贝/细胞;高通量测序结果显示, 8E5-D8细胞有1个整合位点, CD19-CAR-Jurkat 2-6细胞有13个整合位点, 与拷贝数检测结果一致。这些整合位点均通过OGM法在染色体亚显微水平进一步得到确认。结论对8E5-D8细胞和CD19-CAR-Jurkat 2-6细胞的插入拷贝数及整合位点的鉴定结果表明, 其可作为进一步研制CAR-T细胞慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品。

• 单位
  中国食品药品检定研究院