基于RecAb系统的鲍曼不动杆菌Omp33-36缺陷株的构建及鉴定

作者：王慧璇; 王胜军; 程建军; 蔡伟; 许化溪^*

来源：中国病原生物学杂志, 2020, 15(10): 1117-1130.

DOI：10.13350/j.cjpb.201001

• 鲍曼不动杆菌ATCC17978
• RecAb系统
• Omp33-36基因
• 同源重组
• 基因敲除

目的构建鲍曼不动杆菌ATCC17978外膜蛋白Omp33-36基因缺陷株。方法 pAT04质粒电穿孔鲍曼不动杆菌ATCC 17978所得ATCC17978-pAT04经IPTG诱导后用甘油法制备电穿孔用感受态细菌。以ATCC 17978基因组为模板PCR扩增Omp33-36的上下游基因,以pKD4质粒为模板扩增卡那霉素抗性基因1 477 bp片段,并以上述3种PCR产物割胶回收的混合物作为融合PCR模板,扩增Omp33-36同源臂卡那霉素抗性盒DNA片段(2 111 bp);以此融合PCR产物为模板巢式PCR扩增同源臂卡那霉素抗性盒DNA片段(1 977 bp)并电穿孔至感受态ATCC17978-pAT04;经卡那霉素筛选及PCR鉴定得到同源重组菌株ΔOmp::FRT-kanR(pAT04),去除pAT04质粒,得到菌株ΔOmp::FRT-kanR。将pAT03质粒电穿孔感受态Omp::FRT-kanR细菌,得到ΔOmp::FRT-kanR(pAT03)菌株,再经IPTG诱导表达FLP重组酶去除卡那霉素抗性基因,得到ΔOmp::FRT(pAT03)菌株,进一步去除pAT03质粒后得到敲除Omp33-36基因的目的菌株ΔOmp::FRT并测序鉴定。超速离心法提取细菌OMVs并进行SDS-PAGE;E-test测定ATCC17978野生株和Omp33-36敲除株对碳青霉烯类的最低抑菌浓度(MIC)值。结果成功构建鲍曼不动杆菌Omp33-36敲除株ΔOmp::FRT,测序表明敲除的Omp33-36基因座位被FRT序列及卡那霉素扩增引物序列所替代。从Omp33-36敲除株ΔOmp::FRT提取的OMVs经SDS-PAGE电泳显示,与野生株相比约33 ku蛋白组分几尽缺失。敲除株ΔOmp::FRT对美罗培南的MIC值高于野生株。结论利用RecAb系统成功敲除鲍曼不动杆菌外膜蛋白Omp33-36基因,建立了Omp33-36缺陷株,其对美罗培南的耐受性增高。

• 单位
  江苏大学