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摘要
目的探讨糖化碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)影响人真皮微血管内皮细胞(HDMEC)增殖及血管化效应的受体途径。方法采用实验研究方法。采用葡萄糖、bFGF制备糖化bFGF刺激液。取第3～6代HDMEC进行实验。取细胞,分为小干扰RNA(siRNA)-阳性对照组、siRNA-阴性对照组、siRNA-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)组和siRNA-成纤维细胞生长因子受体(FGFR)组,分别转染siRNA-阳性对照3-磷酸甘油醛脱氢酶、siRNA-阴性对照、siRNA-RAGE和siRNA-FGFR 4～6 h,之后加入HDMEC培养基常规培养,反转录PCR法鉴定siRNA转染效果。取细胞,分为正常对照组、单纯糖化bFGF组、单纯siRNA-RAGE组、siRNA-RAGE+糖化bFGF组,接种于96孔板和6孔板。单纯siRNA-RAGE组、siRNA-RAGE+糖化bFGF组细胞转染siRNA-RAGE之后,加入HDMEC培养基常规培养,2 d后,弃去原HDMEC培养基,单纯siRNA-RAGE组细胞加入HDMEC培养基常规培养,siRNA-RAGE+糖化bFGF组细胞加入糖化bFGF刺激液常规培养;正常对照组细胞采用HDMEC培养基常规培养;单纯糖化bFGF组细胞采用糖化bFGF刺激液常规培养。取细胞,同前转染siRNA-RAGE后,接种于48孔板,分为单纯siRNA-RAGE组和siRNA-RAGE+糖化bFGF组;另取细胞不转染直接同前接种到48孔板,分为正常对照组及单纯糖化bFGF组,4组分别同前处理。取细胞,分为正常对照组、单纯糖化bFGF组、单纯siRNA-FGFR组、siRNA-FGFR+糖化bFGF组,分别接种于96、6、48孔板中,相应处理同前,仅siRNA-RAGE换为siRNA-FGFR。采用细胞计数试剂盒8法测定培养2 d细胞增殖活性(样本数为6),流式细胞术检测培养2 d细胞凋亡情况(样本数为3),成管实验检测培养6 h细胞成管能力(样本数为4)。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验。结果 200 bp条带处,未见siRNA-阳性对照组、siRNA-RAGE组和siRNA-FGFR组表达目的基因,可见siRNA-阴性对照组表达目的基因,说明siRNA转染成功。培养2 d后,单纯糖化bFGF组细胞吸光度值明显低于正常对照组(t=2.359,P<0.05);siRNA-RAGE+糖化bFGF组细胞吸光度值明显高于单纯糖化bFGF组(t=3.858,P<0.01),与单纯siRNA-RAGE组相近(t=2.148,P>0.05)。培养2 d后,siRNA-FGFR+糖化bFGF组细胞吸光度值与单纯糖化bFGF组相近(t=0.805,P>0.05),但明显低于单纯siRNA-FGFR组(t=4.201,P<0.01)。培养2 d后,单纯糖化bFGF组细胞凋亡率明显高于正常对照组(t=2.416,P<0.05),siRNA-RAGE+糖化bFGF组细胞凋亡率明显低于单纯糖化bFGF组和单纯siRNA-RAGE组(t=3.861、2.724,P<0.05或P<0.01)。培养2 d后,正常对照组、单纯糖化bFGF组、单纯siRNA-FGFR组、siRNA-FGFR+糖化bFGF组细胞凋亡率组间总体比较,差异无统计学意义(F=2.218,P>0.05)。培养6 h后,正常对照组细胞小管成环数[(636±5)个]明显多于单纯糖化bFGF组[(580±8)个,t=10.825,P<0.01],siRNA-RAGE+糖化bFGF组细胞小管成环数[(647±10)个]明显多于单纯糖化bFGF组和单纯siRNA-RAGE组[(628±4)个,t=13.040、3.641,P<0.01]。培养6 h后,siRNA-FGFR+糖化bFGF组细胞小管成环数[(619±5)个]明显多于单纯糖化bFGF组(t=9.000,P<0.01),但少于单纯siRNA-FGFR组[(632±3)个,t=2.814,P<0.05]。结论糖化bFGF通过RAGE途径影响HDMEC的增殖和血管生成,可能是造成糖尿病皮肤创面难愈的原因之一。
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