嗜肺军团菌激活Nrf2-Keap1通路抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞自噬

作者：盛琳琳; 曹秀琴; 甄庆洁; 杨晓辰; 杨志伟^*

来源：细胞与分子免疫学杂志, 2019, 35(10): 878-885.

DOI：10.13423/j.cnki.cjcmi.008919

• 嗜肺军团菌(LP)
• 巨噬细胞
• 自噬
• 抑制作用

目的观察嗜肺军团菌(LP)对RAW264.7巨噬细胞自噬流及其自噬相关因子表达水平的影响并探讨其作用机制。方法活的LP和灭活的LP[感染复数(MOI)=10, 50, 100]分别处理RAW264.7巨噬细胞1、 2、 3 h,通过筛选得出MOI=50,处理2 h为其最佳作用条件。用雷帕霉素(RAPA)处理RAW264.7巨噬细胞12 h后,再加入活的和灭活的LP共培养2 h,并设正常对照组、 RAPA处理组、活LP组、 RAPA处理的活LP组、灭活LP组和RAPA处理的灭活LP组。用携带双荧光标记蛋白基因和微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)基因的真核过表达质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B转染巨噬细胞,监测巨噬细胞自噬流的变化;用基因芯片在处理的最佳时间点筛选出LP影响巨噬细胞自噬的相关因子溶酶体/内体膜跨膜蛋白封闭蛋白(CLN3)、组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)、 G蛋白信号传导调节蛋白19(RGS19)、肿瘤坏死因子(TNF)、组织蛋白酶B (CTSB)、 GABA A型受体相关蛋白类似物2(GABARAPL2)、 P62、微管相关蛋白1轻链3(LC3);实时荧光定量PCR验证基因芯片结果并检测相关信号通路因子核因子E2相关因子2(Nrf2)、 beclin1和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)的mRNA水平; Western blot法验证基因芯片结果并检测Nrf2、 beclin1和Keap1的蛋白水平。结果与对照组相比,活LP组和灭活LP组的自噬流受到抑制;与RAPA处理组相比,活LP组和灭活LP组自噬流受到抑制。基因芯片检测显示活LP组和灭活LP组LC3的表达下调, P62的表达上调。实时定量PCR、 Western blot验证结果与基因芯片一致。Keap1、 beclin1的mRNA和蛋白水平明显下降, Nrf2 mRNA和蛋白的水平明显增加。结论 LP可抑制巨噬细胞自噬,可能与激活Nrf2-Keap1信号通路有关。

• 单位
  宁夏医科大学; 基础医学院