美洲钩虫抗血小板聚集多肽NaHPI1的分离与活性鉴定

作者：雷蕾; 梁泉燕; 钟芳芳; 崔咏诗; 卢晓湧; 邓莉; 彭礼飞; 邵正^*

来源：热带医学杂志, 2022, 22(05): 601-605.

• 美洲钩虫
• 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列
• NaHPI1
• 血小板聚集抑制剂

目的 从美洲钩虫分离并重组制备一种含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）序列的库尼茨（Kunitz）型多肽-美洲钩虫血小板抑制剂1(Na HPI1)，鉴定重组Na HPI1(r Na HPI1)对血小板聚集的抑制作用。方法通过美洲钩虫成虫全长转录组测序获得Na HPI1完整cDNA序列，通过在线生物信息学网站检索氨基酸序列同源性蛋白并预测信号肽。根据Na HPI1氨基酸序列合成大肠埃希菌密码子偏爱的成熟肽编码基因序列，将该序列连接入表达质粒构建原核表达重组质粒，鉴定正确的重组质粒pET32a-sumo/Na HPI1，转入大肠埃希菌BL21(DE3)中，用IPTG诱导表达，收集菌体超声破碎后，用Ni-NTA亲和层析纯化重组融合蛋白，并在层析柱上进一步用小泛素蛋白样修饰物（SUMO）蛋白酶切割融合伴侣，收集透析液获得r Na HPI1。体外检测r Na HPI1对凝血酶、二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板聚集的抑制作用。结果 通过全长转录组测序获得了编码Na HPI1的全长mRNA，预测其完整编码框编码包括16个氨基酸组成的信号肽和81个氨基酸残基组成的成熟肽。Na HPI1为Kunitz型结构多肽，并在其最后1个半胱氨酸残基之后的羧基端具有RGD序列。利用大肠埃希菌表达系统成功表达并分离纯化获得了r Na HPI1蛋白。10、20和40μg/mL的r Na HPI1蛋白对ADP(20μmol/L)诱导的血小板聚集的抑制率分别为（17.35±2.77）%、（23.33±2.31）%、（30.94±2.03）%，对凝血酶（1 U/mL）诱导的血小板聚集的抑制率分别为（12.85±1.55）%、（20.28±1.17）%、（27.30±2.11）%。r Na HPI1蛋白对凝血酶及ADP诱导的血小板聚集均有明显抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05），并呈一定的剂量依赖关系。结论 本研究分离并鉴定了美洲钩虫的血小板聚集抑制剂Na HPI1的抑制血小板聚集活性，其可能通过抑制血小板聚集而在钩虫吸血时发挥抗凝血作用。

• 单位
  广东医科大学