草鱼白介素10基因的克隆表达及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

作者：胡忠俊; 周昊; 吕丽丽; 李槿年^*

来源：安徽农业大学学报, 2021, 48(01): 73-78.

DOI：10.13610/j.cnki.1672-352x.20210319.021

• 草鱼白介素10
• 克隆表达
• 抗体制备
• 双抗体夹心ELISA

为建立检测草鱼白介素10(Ci IL-10)的双抗体夹心ELISA方法,首先克隆Ci IL-10基因、构建与表达原核表达重组质粒p ET-32a-Ci IL-10,并对表达产物进行纯化,以获得重组Ci IL-10(r Ci IL-10)纯化蛋白。然后,以纯化的r Ci IL-10蛋白为免疫原制备兔源及鼠源抗r Ci IL-10的多克隆抗体,并对其进行纯化与酶标记。最后,以纯化的鼠抗r Ci IL-10抗体为捕获抗体,r Ci IL-10纯化蛋白为夹心抗原,HRP标记的兔抗Ci IL-10纯化抗体为检测抗体,通过优化反应条件,建立双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的优化反应条件包括,捕获抗体的最佳包被浓度为20μg·m L-1,检测抗体的最佳稀释度为1∶3 200,最佳封闭条件是使用5%脱脂奶粉,37°C封闭1.5 h,样品反应时间为2h,以OD450值≥0.174作为阳性判定标准。该方法的板内及板间重复性变异系数小于10%,最低检测限量为24.29ng·m L-1,与草鱼白介素6、草鱼肿瘤坏死因子、小鼠白介素10、小鼠干扰素和小鼠单核细胞趋化蛋白均无交叉反应。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有较好的特异性、重复性和灵敏度,可用于草鱼白介素10的快速检测。

• 单位
  动物科技学院; 安徽农业大学