肿瘤蛋白D52的原核表达及单克隆抗体的制备

作者：王龙珠; 赵亚南; 张跃辉; 王建^*

来源：军事医学, 2019, 43(12): 923-929.

• 肿瘤蛋白D52
• 原核表达
• 抗体
• 纯化
• 酶联免疫吸附

目的重组表达纯化人肿瘤蛋白D52(TPD52),制备其单克隆抗体。方法利用PCR将pFlag-CMV2-Tpd52质粒中的Tpd52全长基因序列扩增,通过酶切、连接插入表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a-Tpd52,用IPTG诱导目的基因在E.coli中表达。表达的TPD52蛋白经纯化后作为抗原免疫小鼠,提取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)融合生成杂交瘤细胞。ELISA筛选分泌TPD52抗体的杂交瘤细胞,Western印迹(WB)筛选抗体特异性较好的杂交瘤细胞,再经有限稀释法分选出单克隆细胞株并用WB鉴定抗体特异性。以抗体特异性较好的单克隆杂交瘤细胞株进行腹水抗体制备,ELISA检测腹水抗体的效价及亚型。通过WB比较制备获得的抗体与商品化抗体并检测不同细胞系中TPD52蛋白的表达情况。结果重组质粒经测序确定插入Tpd52目的基因;SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导6 h后E.coli中表达了大量TPD52融合蛋白;ELISA结果获得了阳性融合细胞,WB确定多克隆抗体和单克隆抗体均能与TPD52蛋白发生特异性反应;ELISA和WB结果表明,获得了高效价的TPD52腹水抗体。结论重组质粒pET-28a-Tpd52在E.coli中高效表达,成功制备了特异性、灵敏度高的TPD52蛋白的单克隆和多克隆抗体。

• 单位
  蛋白质组学国家重点实验室; 安徽医科大学; 北京蛋白质组研究中心