一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

作者：单志新; 林秋雄; 符永恒; 邓春玉; 余细勇

来源：南方医科大学学报, 2007, (09): 1341-1344.

• RNA干扰
• 小发夹RNA
• 绿色荧光蛋白
• 载体

目的建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法。方法制备包含单一限制性内切酶ClaⅠ识别序列的双链DNA插入片段(ClaⅠ位点两侧碱基序列不互补),与BamHⅠ和HindⅢ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含ClaⅠ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-ClaⅠ。用BamHⅠ和HindⅢ酶切pSilencer-4.1-ClaⅠ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含ClaⅠ识别序列)做连接反应,构建GFPshRNA表达质粒。提取阳性克隆质粒DNA,行ClaⅠ单酶切鉴定,对未被ClaⅠ线性化的质粒行DNA测序鉴定。结果DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-ClaⅠ,以pSilencer-4.1-ClaⅠ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被ClaⅠ线性化的均为GFPshRNA表达质粒。结论构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-ClaⅠ,所引入的单一的ClaⅠ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒。

• 单位
  广东省人民医院