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摘要
目的明确环状RNA-SEC31A(circSEC31A)在胰腺癌中的表达水平, 探讨其对胰腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响及潜在的分子机制。方法采用实时荧光定量PCR检测人正常胰腺细胞株HPDE及胰腺癌细胞株BXPC-3、PANC1、CaPan-2、SW1990 circSEC31A的表达水平, 选用表达量较高的胰腺癌细胞株进行后续实验。针对circSEC31A设计两条siRNA(#1、#2), 采用脂质体将siRNA转染胰腺癌细胞沉默circSEC31A表达(siR-circSEC31A组), 以不针对circSEC31A设计的siRNA转染胰腺癌细胞为对照组(siR-NC组), Transwell实验及划痕实验检测circSEC31A对胰腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响。采用circSEC31A探针及oligo阴性对照探针进行RNA Pull-down实验, 筛选与circSEC31A结合的miRNA, 并验证该miRNA对胰腺癌细胞侵袭、迁移的影响。荧光定量PCR检测沉默miR-200c-3p及circSEC31A对胰腺癌细胞PDK1 mRNA表达的影响。蛋白质印迹法检测circSEC31A沉默对PDK1蛋白及下游相关蛋白Akt、磷酸化Akt(p-Akt)表达量的影响。结果胰腺正常细胞株HPDE circSEC31A表达量(1.000±0.120)显著低于胰腺癌细胞株BXPC-3(1.920±0.130)、SW1990(2.93±0.528)、PANC1(4.557±0.692)和CaPan-2(5.247±0.194)的circSEC31A表达量, 差异有统计学意义(P<0.001)。Transwell实验结果显示, 与PANC1 siR-NC组穿膜细胞数(1301.3±94.6)个/100倍视野和CaPan-2 siR-NC组穿膜细胞数(1835.0±70.1)个/100倍视野比较, PANC1 siR-circSEC31A#1组、siR-circSEC31A#2组和CaPan-2 siR-circSEC31A#1组、siR-circSEC31A#2组穿膜细胞数显著下降, 分别为(727.3±92.9)、(792.0±18.1)、(718.0±90.6)、(692.7±84.8)个/100倍镜视野;划痕实验结果显示, 与PANC1 siR-NC组(55.000±4.359)%和CaPan-2 siR-NC组(69.000±3.606)%比较, PANC1 siR-circSEC31A#1组(20.667±3.215)%、siR-circSEC31A#2组(20.000±4.583)%和CaPan-2 siR-circSEC31A#1组(28.000±8.185)%、siR-circSEC31A#2组(29.667±5.686)%的划痕区细胞覆盖率显著降低;RNA Pull-down实验表明, 与PANC1 oligo探针组(1.000±0.091)和CaPan-2 oligo探针组(1.000±0.153)比较, PANC1 circSEC31A探针组(2.237±0.175)和CaPan-2 circSEC31A探针组(2.166±0.156)miR-200c-3p富集量显著升高;与siR-NC组穿膜细胞数(939.3±57.0)、(786.7±51.5)个/100倍镜视野比较, PANC1、CaPan-2细胞siR-miR-200c-3p组穿膜细胞数增加到(1206.0±99.1)、(1838.0±105.7)个/100倍视野, 而siR-miR-200c-3p+siR-circSEC31A组穿膜细胞数又下降到(932.7±116.4)、(785.3±58.8)个/100倍镜视野;与siR-NC组(1.000±0.103、1.000±0.107)比较, PANC1、CaPan-2细胞siR-miR-200c-3p组PDK1 mRNA表达量(1.898±0.159、2.102±0.337)显著升高, 而siR-miR-200c-3p+siR-circSEC31A组PDK1 mRNA表达量又显著下降到(0.980±0.070、1.015±0.079);蛋白质印迹法结果显示, PANC1 siR-NC组、siR-circSEC31A#1组、siR-circSEC31A#2组PDK1蛋白表达量分别为0.767±0.086、0.281±0.191、0.333±0.062, CaPan-2各组PDK1蛋白表达量分别为0.712±0.038、0.353±0.061、0.308±0.018;PANC1各组p-Akt蛋白表达量分别为0.741±0.050、0.114±0.027、0.139±0.041, CaPan-2各组p-Akt蛋白表达量分别为0.823±0.052、0.141±0.045、0.280±0.089。siR-circSEC31A组PDK1、p-Akt蛋白表达量均显著低于siR-NC组。以上各组间比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论 circSEC31A在胰腺癌细胞中高表达, 通过介导miR-200c-3p/PDK1/Akt轴来促进胰腺癌的侵袭转移。circSEC31A可能成为胰腺癌患者早期诊疗潜在的新靶点。
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