基于多重PCR靶向测序技术建立临床病原菌检测方法

作者：黄晓园; 郑凯文; 张俊杰; 徐鸿绪; 王菊芳

来源：分子诊断与治疗杂志, 2023, 15(09): 1473-1477.

DOI：10.19930/j.cnki.jmdt.2023.09.013

• 二代测序
• 多重PCR
• 临床病原菌
• 高通量检测

目的 针对不同临床样本（肺泡灌洗液、痰液、血液）中常见的22种病原菌，建立一种基于多重PCR靶向二代测序（mPCR-NGS）的高通量检测方法。方法 选取2018年10月至2019年2月中山大学附属第一医院和广州军区广州总医院共84例临床样本和5种病原菌混合的模拟感染样本，对检测方法进行测试，并根据测序序列区分病原菌种类。通过生物信息学方法筛选和设计三种临床样本中常见22种病原菌的特异性引物，并通过多重PCR和二代测序调整引物扩增效率，建立多重PCR靶向二代测序高通量检测体系。结果 PCR验证结果表明，针对22种病原菌所设计的44对引物均具有良好特异性；引物终浓度经调整，扩增均一值在0.33～2.37之间。本研究建立的mPCR-NGS方法对鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、肺炎链球菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌5种菌混合的模拟样本进行验证，其检测下限是3 copies。在11例血液样本中，有6例样本属于单一感染，与临床结果完全一致；5例样本属于混合感染，其中样本1、3、7、10的病原菌感染种类与临床结果不完全一致。在84例临床样本检测中，mPCR-NGS共检测出16种病原菌，其中检出最多的病原菌是鲍曼不动杆菌（28/84），次之是缓症链球菌（13/84），第三位是嗜麦芽窄食单胞菌（12/84）;mPCR-NGS检测阳性率为69.05%，高于临床培养结果的阳性率（53.57%）；两种检测方法结果完全一致的样本共39例，总一致率为46.43%。结论 多重PCR靶向二代测序检测技术是一种快速、准确、高效的检测方法，可用于肺泡灌洗液、痰液、血液中22种临床常见病原菌的快速、高通量检测。

• 单位
  华南理工大学; 中山大学附属第一医院