多基因同步调控结合高通量筛选构建高产L-苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株

作者：薛宁; 王瑾; 李世新; 刘叶; 程海娇; 张玥; 毛雨丰; 王猛^*

来源：生物技术通报, 2023, 39(09): 268-280.

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0280

• 多基因同步调控
• 碱基编辑技术
• L-苯丙氨酸
• 谷氨酸棒杆菌
• 代谢工程改造
• 高通量筛选
• 液滴微流控
• 生物传感器

L-苯丙氨酸（L-Phe）是重要的食品及医药中间体，但由于其生物合成途径较长且调控机制复杂，仅依靠质粒或者周期漫长的基因组逐轮改造，难以实现各个模块之间的通量平衡，在一定程度上限制了其产量的进一步提升。本研究将L-Phe生物合成途径中的7个携带组成型启动子PF11及核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS）为GGGGGGGG的关键基因ppsA、tktA、aroFfbr、aroE、aroL、pheAfbr和tyrB，整合到谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的基因组中；利用课题组前期研发的基于CRISPR/Cas系统和胞苷脱氨酶的无模板基因表达调控技术（base editor-targeted and template-free expression regulation, BETTER），对每个关键基因的RBS进行同步编辑，生成富含G/A的RBS突变文库；利用前期开发的荧光蛋白型L-Phe生物传感器结合液滴微流控系统（droplet microfluidics）对RBS突变文库进行高通量筛选。最终，从大约7万个RBS突变文库中筛选到4株L-Phe产量提升不同程度的突变菌株，其72 h摇瓶发酵产量分别为2.06、1.30、4.42和7.44 mmol/L，相比对照菌株C.g-2(0.6 mmol/L)分别提高了2.43、1.17、6.37、11.40倍。利用碱基编辑器同时调节多基因的表达水平并筛选组合文库，可以为L-Phe工程育种提供一种可行策略。

• 单位
  天津科技大学; 生物工程学院; 中国科学院天津工业生物技术研究所