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摘要
tRNA可以将多个sgRNAs连接起来合并成一个多顺反子基因，再与CRISPR/Cas9表达载体结合形成多顺反子tRNA-sgRNA/Cas9(PTG/Cas9)系统来对多靶点进行基因编辑。该系统已经在水稻中验证其可促进sgRNAs的转录和提高多靶点的编辑效率。因此，为了在多年生黑麦草中实现高效的基因编辑，本研究中，构建了2个带有tRNA的CRISPR中间载体，并提供了一种快速、灵活的PTG/Cas9载体构建方法。为了快速验证PTG/Cas9系统是否可以在多年生黑麦草基因组中发挥功能，用聚乙二醇4000(PEG 4000)介导PTG/Cas9质粒转化多年生黑麦草原生质体，后提取原生质体DNA扩增目的序列检测是否有目标基因被编辑的细胞。试验结果显示，PTG/Cas9系统可用于多年生黑麦草基因编辑，且基因编辑效率约为6.7%。试验结果为多年生黑麦草遗传研究和育种提供了重要的基础。
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