非病毒载体介导脑源性神经营养因子基因的体外转染小鼠耳蜗螺旋神经节细胞实验研究

作者：吴雄辉; 赵斯君; 李赟; 谢江

来源：中国耳鼻咽喉头颈外科, 2020, 27(10): 576-579.

DOI：10.16066/j.1672-7002.2020.10.007

• 动物实验
• 小鼠
• 耳蜗
• 转染
• 纳米载体
• 脑源性神经营养因子基因

目的探究经聚醚酰亚胺(polyetherimide,PEI)表面修饰后的纳米羟基磷灰石载体介导脑源性神经营养因子(derived neurotrophic factor,BDNF)体外转染效率,表达产物对庆大霉素所致小鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGCs)细胞损伤的保护作用。方法构建经PEI表面修饰的纳米羟基磷灰石载体和BDNF基因真核表达质粒,体外培养并转染小鼠耳蜗SGCs细胞;分别采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹和细胞计数试剂盒kit-8(cell counting kit-8,CCK-8)细胞毒实验,检测体外培养小鼠耳蜗SGCs细胞及纳米羟基磷灰石载体介导BDNF基因的体外转染及表达效率,对耳毒性药物庆大霉素所致SGCs细胞损伤的保护作用。结果 DNA核酸电泳结果显示成功构建带有巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子的BDNF真核表达质粒;qRT-PCR和蛋白质免疫印迹结果显示与转染空质粒对照组相比,转染BDNF表达载体构建后SGCs原代细胞中BDNF的mRNA水平显著上调4.19倍(t=5.744,P<0.05),蛋白水平显著上调3.03倍(t=6.627,P<0.05),差异有统计学意义。此外,蛋白质免疫印迹和CCK8细胞毒实验结果表明,庆大霉素处理可显著抑制小鼠耳蜗SGCs细胞内BDNF基因表达,加剧细胞毒性,转染纳米羟基磷灰石载体介导qRT-PCR BDNF基因可明显逆转庆大霉素对SGCs的细胞毒作用,差异有显著统计学意义(t=10.015,P<0.01)。结论经PEI表面修饰的纳米羟基磷灰石载体可显著增强BDNF基因的跨膜能力,显著上调SGC细胞内BDNF表达产物的表达及对庆大霉素所致SGCs细胞损伤的保护作用,为内耳基因治疗的临床开展及应用提供实验和理论依据。

• 单位
  湖南省儿童医院