利用ChIP-seq/双荧光素酶报告基因技术验证PPARγ2的靶向基因MYH7

作者：张仙玉; 左中^*; 毛敏

来源：基因组学与应用生物学, 2022, 41(01): 223-230.

DOI：10.13417/j.gab.041.000223

• 2型过氧化物酶体增殖激活受体γ
• 肌球蛋白重链
• 染色质免疫共沉淀
• 高通量测序
• 双荧光素酶报告基因技术

为验证2型过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ2, PPARγ2)对编码β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)基因MYH7的靶向调控机制及其结合位点，本研究将pTT5空载体和pTT5-3flag-PPARγ2质粒分别转染小鼠心肌细胞(mouse cardiac myocytes, MCM),RT-qPCR和Western blot检测MYH7和PPARγ2的表达情况；利用染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipita-tion, ChIP)特异性富集并纯化MCM中可与PPARγ2结合的DNA片段，通过高通量测序技术(high-throughput sequencing, HiSeq)检测和分析可直接与PPARγ2结合的基因。采用生物信息学软件预测PPARγ2结合于靶标基因MYH7的启动子区，并将预测到的转录因子结合位点和相应的突变位点分别插入pgl3-basic载体的萤火虫荧光素酶基因上游，构建野生型和突变型荧光素酶报告质粒，再分别与pcDNA3.1载体、pcDNA3.1-PPARγ2质粒和海肾荧光素酶基因载体pRL-TK共转染293T细胞，检测荧光素酶相对活性。实验结果表明：ChIP-seq初步验证了MYH7是PPARγ2直接调控的可能靶向基因；经基因测序验证MYH7野生型和突变型荧光素酶质粒(pgl3-basic-MYH7-WT、pgl3-basic-MYH7-mut)构建成功；双荧光素酶报告基因检测显示，与MYH7-WT+pcDNA3.1组的相对荧光素酶活(0.366±0.021)相比，MYH7-WT+pcDNA3.1-PPARγ2组的相对荧光素酶活性(2.477±0.212)增强，差异具有统计学意义(P<0.001);与MYH7-WT+pcDNA3.1-PPARγ2的相对荧光素酶活(2.477±0.212)相比，MYH7-mut+pcDNA3.1-PPARγ2组的相对荧光素酶活性(2.677±0.201)无明显变化(P>0.05)。本研究通过ChIP-seq/双荧光素酶报告基因技术初步验证PPARγ2能够直接结合MYH7的启动子区域并靶向正调控MYH7基因的表达。

• 单位
  重庆医科大学附属第一医院; 重庆医科大学