鹅多瘤病毒VP1基因的克隆及EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

作者：万春和; 刘荣昌; 程龙飞; 施少华; 傅光华; 陈红梅; 傅秋玲; 陈翠腾; 黄瑜^*

来源：中国兽医学报, 2018, 38(12): 2289-2295.

DOI：10.16303/j.cnki.1005-4545.2018.12.10

• 鹅多瘤病毒
• VP1基因
• EvaGreen实时荧光定量PCR方法
• 樱桃谷鸭
• 麻鸭

针对鹅多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV)VP1基因核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,从1株樱桃谷鸭源GHPV(命名为FJ201601株)扩增获得VP1基因核苷酸序列全长,并进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其VP1基因分子特征。基于GHPV各分离株VP1基因特点,设计特异性的实时荧光定量PCR引物,建立基于EvaGreen实时荧光定量PCR检测GHPV方法。结果显示,克隆的FJ201601株VP1基因全长为1 062bp,与GHPV各参考分离株核苷酸同源性为99.7%～100.0%;在遗传进化上可将GHPV分为2个大的遗传进化分支(Clade 1和Clade 2),FJ201601株属于Clade 2分支。建立的EvaGreen检测GHPV实时荧光定量PCR检测方法,其标准曲线方程y轴截距为39.12,斜率为-3.489,扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.7%;敏感性强,最低检测限为88.0拷贝/μL;特异性好,扩增产物的溶解曲线分析只出现单一的特异峰,Tm值为(82.18±0.22)℃,无引物二聚体,对水禽常见病原检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.62%～1.76%和0.92%～2.44%。用建立的检测方法对80份多品种生长不良鸭进行检测发现4份阳性(樱桃谷鸭2份、麻鸭2份),阳性率为5%(4/80)。本研究证实麻鸭中存在GHPV感染,为丰富GHPV感染宿主谱和开展GHPV感染流行病学调查和致病机理研究提供检测手段。

• 单位
  福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心; 福建省禽病防治重点实验室; 福建省农业科学院