科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的通过脂多糖(LPS)建立脓毒症相关性脑病(SAE)体外模型, 探讨人髓样分化蛋白2(MD2)在LPS导致神经元死亡过程中的作用及内在机制。方法选择健康C57BL/6J孕鼠, 孕期14～18 d, 取胎鼠脑皮质组织, 用0(空白对照组)、1、5和10 g/L的LPS刺激神经元后24 h, 检测乳酸脱氢酶(LDH)释放量, 观察神经元死亡情况, 并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子白细胞介素(IL-6、IL-1β)水平, 以确定建立SAE体外神经炎症模型的最佳LPS剂量。将细胞分为空白对照组和LPS组, 用原位末端缺刻标记法(TUNEL)染色检测细胞凋亡情况, 用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测相关蛋白标志物活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达、坏死性凋亡相关蛋白神经元受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)及磷酸化RIPK3(p-RIPK3)水平, 用免疫荧光化学染色检测p-RIPK3和微管相关蛋白2(MAP2)的表达, 以评估细胞死亡类型及神经元死亡程度;用Western blotting法检测MD2表达, 免疫荧光化学染色观察p-RIPK3及MD2在神经元中的表达和分布, 以评估MD2是否参与炎症反应促进神经元死亡。此外, 将细胞分为空白对照组、LPS组和MD2干扰肽组(LPS+TC组), 检测IL-6、IL-1β、LDH水平, 评估干扰MD2能否减轻LPS诱导的神经炎症。结果 10 g/L LPS可诱导明显的神经元死亡, 该浓度刺激神经元24 h后LDH释放量较空白对照组明显增加(相对释放量:1.45±0.04比1.00±0.00, P<0.01), 神经元发生凋亡及坏死性凋亡, 炎症因子IL-6、IL-1β水平显著增加〔IL-6(相对水平):1.94±0.04比1.00±0.00, IL-1β(相对水平):1.53±0.09比1.00±0.00, 均P<0.01〕。与空白对照组比较, LPS组TUNEL检测细胞凋亡明显增多, 活化caspase-3表达明显增加(活化caspase-3/GAPDH:1.55±0.10比1.00±0.00, P<0.01), p-RIPK3/RIPK3比值明显升高(相对值:1.54±0.06比1.00±0.00, P<0.05), 神经元周围p-RIPK3表达显著增多, 提示脓毒症环境下神经元发生显著凋亡及坏死性凋亡。同时, 与空白对照组比较, LPS组MD2表达量显著增加(MD2/GAPDH:1.91±0.07比1.00±0.00, P<0.01), 神经元周围MD2表达显著增多, 提示LPS诱导的MD2上调可能在脓毒症神经炎症及诱导神经元死亡中发挥关键作用。此外, 与LPS组比较, MD2干扰肽能够降低炎症因子IL-6、IL-1β的表达水平〔IL-6(相对水平):1.16±0.08比1.94±0.04, IL-1β(相对水平):1.15±0.05比1.75±0.09, 均P<0.01〕, 减少LDH释放(相对释放量:1.09±0.01比1.44±0.04, P<0.05)。结论 LPS刺激神经元通过MD2诱导神经元炎症反应, 最终导致神经元发生凋亡和坏死性凋亡;干扰MD2功能可减轻炎症, 抑制神经元死亡。
- 单位
