猪NLRP3基因Real-time PCR检测方法的建立及应用

作者：刘博; 张倩; 莫玲; 林盼盼; 谷英华; 刘海隆; 蔡青云; 张艳^*; 王文秀^*

来源：动物医学进展, 2023, 44(09): 19-23.

DOI：10.16437/j.cnki.1007-5038.2023.09.004

• NLRP3基因
• 实时荧光定量PCR
• 猪肺炎支原体

根据NCBI NLRP3 cds(NM-001256770)序列设计1对特异性引物，构建标准品质粒pMD18T-NLRP3-189。通过反应条件优化、稳定性、敏感性等试验，成功建立了NLRP3的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法，用该方法定量检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染后的猪肺组织中NLRP3表达水平。最佳引物浓度为0.15μmol/L,建立的标准曲线方程为y=-3.5196x+36.968,E值为0.96,最低检测量为84个拷贝，熔解曲线有单一峰，批内变异系数CV为0.067%～0.184%,批间变异系数为0.221%～0.594%,重复性好。该方法检测仔猪在感染Mhp后肺组织中的NLRP3 mRNA表达水平，感染组与健康组相比差异显著(P<0.01),NLRP3表达水平明显增高，在感染后14 d可达到高峰，平均mRNA拷贝数达18 000左右，可持续42 d。表明该检测方法稳定性良好，精确度高，特异性强，为进一步研究猪炎症小体NLRP3的激活及其相关炎症反应机制提供了技术支持。

• 单位
  海南省农业科学院畜牧兽医研究所; 山东省滨州畜牧兽医研究院