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摘要
目的探讨缺氧诱导因子-1α/Bcl-2/E1B-19kDa相互作用蛋白3(HIF-1α/BNIP3)介导的线粒体自噬对创伤性脑损伤(TBI)后神经元凋亡的影响。方法选择HT22细胞(小鼠海马神经元)进行实验, 采用氧糖剥夺复氧(OGD/R)的方法构建TBI的体外模型, 通过HIF-1α、BNIP3特异性小干扰RNA(siRNA)或质粒载体转染细胞调节HIF-1α、BNIP3表达。实验1:研究BNIP3介导的线粒体自噬对TBI后神经元凋亡的影响。这部分实验中HT22细胞分为4组(n=3):siRNA对照组, 转染阴性siRNA后正常培养;siRNA+TBI组, 转染阴性siRNA后进行OGD/R处理;BNIP3-siRNA组, 转染BNIP3-siRNA后正常培养;BNIP3-siRNA+TBI组, 转染BNIP3-siRNA后进行OGD/R处理。实验终点通过Western blotting法检测HIF-1α、BNIP3及LC3-Ⅱ、P62等线粒体自噬相关蛋白的表达水平, 透射电镜观察线粒体自噬小体, TUNEL染色法检测细胞凋亡率, 乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞上清液LDH活性。实验2:研究HIF-1α对TBI后BNIP3介导的线粒体自噬及神经元凋亡的影响。这部分实验中HT22细胞分为8组(n=3):siRNA对照组及siRNA+TBI组, 处理同上;HIF-1α-siRNA组, 转染HIF-1α-siRNA后正常培养;HIF-1α-siRNA+TBI组, 转染HIF-1α-siRNA后进行OGD/R处理;空载质粒组, 转染空载质粒pcDNA3.1(+)后正常培养;过表达HIF-1α组, 转染过表达HIF-1α质粒后正常培养;空载质粒+TBI组, 转染空载质粒后进行OGD/R处理;过表达HIF-1α+TBI组, 转染过表达HIF-1α质粒后进行OGD/R处理。实验终点测定各组细胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ、P62、TOMM20、COX Ⅳ表达水平、细胞凋亡率及LDH活性。结果 (1)实验1:与siRNA对照组比较, siRNA+TBI组BNIP3表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著升高, P62、TOMM20、COX Ⅳ表达水平显著下降, 细胞凋亡率及LDH活性显著升高, 差异均有统计学意义(P<0.05)。与siRNA+TBI组比较, BNIP3-siRNA+TBI组BNIP3表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著下降, P62、TOMM20、COX Ⅳ表达水平显著升高, 细胞凋亡率及LDH活性显著升高, 差异均有统计学意义(P<0.05)。透射电镜下siRNA+TBI组自噬小体较siRNA对照组增多, BNIP3-siRNA+TBI组自噬小体较siRNA+TBI组减少。(2)实验2:与siRNA+TBI组比较, HIF-1α-siRNA+TBI组HIF-1α、BNIP3表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著下降, P62、TOMM20、COX Ⅳ表达水平显著升高, 细胞凋亡率及LDH活性显著升高, 差异均有统计学意义(P<0.05)。与空载质粒+TBI组比较, HIF-1α过表达+TBI组HIF-1α、BNIP3表达水平及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著升高, P62、TOMM20、COX Ⅳ表达水平显著下降, 细胞凋亡率及LDH活性显著下降, 差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 HIF-1α通过促进BNIP3介导的线粒体自噬减轻TBI后神经元凋亡。
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