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摘要
目的探索内源性神经干细胞在大鼠海马可溶性因子中的体外发育归宿及分化鉴定。方法显微镜下分离Wistar大鼠海马组织放置于低温DMEM/12培养基,低温振荡2小时后高速离心(15000 g),获取实验所用海马组织可溶性因子。取材出生1天的Wistar乳鼠海马中的内源性神经干细胞(endogenous neural stem cells,ENSCs),将ENSCs分别于含海马可溶性因子终浓度为0(对照组)、50、100、200、400μl/m L的无血清DMEM/F12培养基中培养6天并每日观察,使用免疫细胞化学、Western Blot印记技术比较各组ENSCs中Nestin、CD133的表达量;同时计量并比较各组ENSCs成球个数,以探索在模拟颅内微环境情况下,ENSCs发育、归宿及分化。进一步于最适宜的海马可溶性因子终浓度中分化神经球,对分化的细胞行神经元特异性蛋白入(如:β-tubullin III、MAP2)及胶质细胞特异性蛋白(如:GFAP、S100及p75 NGFR)免疫细胞化学检测。结果大鼠ENSCs在培养基中呈单细胞漂浮生长,球形;ENSCs于海马可溶性因子各实验分组中培养第2天呈细胞球状态,对照组中无细胞球形成(与100μl/m L组比较,P1=0.00),100μl/m L组与对照组比较有统计学意义(P1=0.00<0.05);至第6天,在100μl/m L组中的细胞球数量明显多于其余各组(P1’=P2’=P3’=P4’=0.00)。在免疫细胞化学检测中,100μl/m L组中细胞球表达干细胞高亲和蛋白Nestin、CD133阳性,Western Blot免疫印迹检测其中Nestin、CD133蛋白高于对照组。进一步分化试验中,细胞球呈贴壁生长的单细胞状态、有突起伸出、长梭形,免疫细胞化学检测分化的细胞表达胶质细胞特异性蛋白GFAP、S100、p75NGFR阳性,但不表达神经元特异性蛋白β-tubullin III与MAP2。结论大鼠ENSCs在终浓度为100μl/m L的HSF作用下,可促进ENSCs的增殖分裂;ENSCs在同样浓度下的HSF中可进一步分化为表达GFAP、S100、p75NGFR阳性的胶质样细胞;100μl/m L的HSFS是ENSCs的一种生理性诱导剂或参与促进ENSCs增殖、分化及通过细胞替代或因子分泌等机制修复神经损伤。
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