CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因及表型分析

作者：梁森; 李帅庭; 袁志; 黄慧哲^*

来源：第三军医大学学报, 2019, 41(15): 1445-1452.

DOI：10.16016/j.1000-5404.201902114

• CRISPR/Cas9
• lkb1
• 斑马鱼

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因,观察和验证纯合子表型,初步探讨Lkb1对肾小管发育的影响。方法针对斑马鱼lkb1基因设计并体外合成gRNA,通过显微注射技术将gRNA和Cas9 mRNA注入野生型胚胎一细胞期卵黄中,利用T7E1酶切和测序筛选出高效gRNA,通过测序筛选出F0代突变体及可遗传突变体,野生鱼和可遗传突变体鱼杂交产生F1代杂合子突变体,测序鉴定F1代杂合子突变类型,通过F1代杂合子自交产生F2代纯合子幼鱼,通过观察鉴定出纯合子表型;通过RT-PCR和免疫印迹验证纯合子表型。结果制备了斑马鱼lkb1 gRNA和Cas9 mRNA,筛选出3种产生移码突变的杂合子,发现斑马鱼lkb1基因敲除纯合子幼鱼受精后第5天游动时头尾剧烈摆动,异常兴奋,鱼鳔缺失,体轴弯曲,卵黄消耗过快,肝脏暗淡,肠道水肿;第9天大多数死亡;纯合子g6pase、pdk2b、pcpck1 mRNA显著升高,Lkb1完全不表达;肾小管标志蛋白mRNA显著升高。结论利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因产生了多种表现,包括肝脏衰竭、肠道水肿、体轴弯曲、鱼鳔缺失、早期致死的表型,同时表明Lkb1对斑马鱼肾小管发育有影响。

• 单位
  基础医学院; 重庆医科大学