利用核酸适配体封闭Tth DNA聚合酶突变体实现温启动一步法RT-qPCR

作者：张雅琪; 张建; 唐雨婷; 黄庆媛; 季璐; 卢辰; 罗志丹^*

来源：中国生物工程杂志, 2023, 43(04): 51-58.

DOI：10.13523/j.cb.2211014

• 核酸适配体
• Tth DNA聚合酶突变体
• 温启动
• 一步法RT-qPCR

目的：Tth DNA聚合酶是一种同时具备DNA聚合酶和逆转录酶活性的耐热型工具酶。为消除其在一步法逆转录-实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative real-time PCR,RT-qPCR)反应时的非特异性扩增，筛选可在较低温度下抑制其活性的核酸适配体，从而实现温启动一步法RT-qPCR。方法：在前期获得不依赖Mn2+的Tth DNA聚合酶突变体的基础上，检验四种DNA适配体及其对应的RNA适配体对Tth DNA聚合酶突变体的DNA聚合酶活性和逆转录酶活性的封闭效果以及解离温度，并通过分子对接模拟适配体与聚合酶的结合模式。结果：TQ21-11和TQ21-11-RNA两种适配体在40℃可有效抑制Tth DNA聚合酶的DNA聚合酶活性和逆转录酶活性，抑制率达到97%以上；两种适配体在50℃可几乎完全解离。这两种适配体均可用于温启动一步法RT-qPCR,其中TQ21-11-RNA的非特异性扩增更低。结论：利用TQ21-11和TQ21-11-RNA两种适配体在室温下封闭Tth DNA聚合酶突变体活性，可以实现温启动一步法RT-qPCR。