3β-HSD基因沉默细胞株的建立及其对DEHP致凋亡的影响

作者：王利; 秦逍云; 徐新云^*; 曾怀才; 郑凯; 王冰玉; 龙鼎新

来源：中华劳动卫生职业病杂志, 2019, 37(01): 13-19.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-9391.2019.01.003

• 3β-羟类固醇脱氢酶
• 基因沉默
• 邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯
• 细胞凋亡

目的 构建3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)基因shRNA慢病毒干扰载体,建立3β-HSD基因沉默细胞株,研究3β-HSD基因沉默对塑化剂邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(DEHP)致凋亡的影响。方法 根据GenBank提供的3β-HSD基因mRNA序列,设计合成3条干扰序列,退火后连接到PLVX-shRNA2-puro中,将重组慢病毒载体转染293FT细胞,收集病毒上清,感染MCF-7细胞。利用嘌呤霉素筛选得到3β-HSD沉默细胞株,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)对干扰效果进行鉴定。用不同剂量DEHP对MCF-7细胞和3β-HSD沉默细胞染毒24 h,检测凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-8的基因和蛋白表达水平的变化。结果 该实验插入慢病毒载体PLVX-shRNA2-puro中的3β-HSD基因干扰序列与设计的序列一致；3β-HSD沉默细胞中3β-HSD基因表达水平较对照组MCF-7细胞降低77%,3β-HSD蛋白表达水平较对照组MCF-7细胞降低74%。不同剂量DEHP染毒3β-HSD沉默细胞和MCF-7细胞后,qRT-PCR结果显示,MCF-7细胞中Bax基因表达水平较对照组(0 mmol/L DEHP)升高28%～54%,Caspase-3基因表达水平升高13%～49%,Caspase-8基因表达升高21%～70%。与同染毒剂量组的MCF-7细胞比较,3β-HSD沉默细胞中Bax基因表达水平降低11%～28%,Caspase-3基因表达降低12%～23%,Caspase-8基因表达降低11%～34%。Western blot结果显示,MCF-7细胞中BAX蛋白表达水平较对照组升高28%～61%,Caspase-3蛋白表达升高40%～48%,Caspase-8蛋白表达升高31%～84%。与同染毒剂量组的MCF-7细胞比较,3β-HSD沉默细胞Bax蛋白表达水平降低11%～27%,Caspase-3蛋白表达降低21%～40%,Caspase-8蛋白表达降低12%～25%。结论 该研究成功构建了3β-HSD基因沉默细胞株。DEHP可引起细胞凋亡基因及蛋白表达升高,3β-HSD基因沉默能在一定程度上抑制DEHP对凋亡基因的活化。

• 单位
  深圳市疾病预防控制中心; 公共卫生学院; 南华大学