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摘要
目的探讨重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)凝胶对糖尿病大鼠创面愈合及创面组织中微小RNA表达的影响。方法取18只雄性清洁级SD大鼠建立糖尿病模型。4周后取稳定成模的16只糖尿病大鼠,于背部两侧制作4个全层皮肤缺损创面,共64个创面。采用配对设计以脊柱两侧对称的创面配对,采用盲法(用红蓝两色标识rhGM-CSF或凝胶基质)及随机数字表法分为2组,每组32个创面;A组采用红色标签药剂、B组采用蓝色标签药剂。2组大鼠均每日涂抹药膏1次,厚度为3 mm,至伤后14 d。伤后3、7、14 d,大体观察各组创面愈合情况;计算伤后3、7 d创面愈合率。伤后3、7、14 d,每组分别采集2、4、8个创面标本行HE染色观察组织病理学改变,免疫组织化学染色检测创面CD31和增殖细胞核抗原(PCNA)表达(数据以吸光度值表示)。伤后7 d每组另采集6个创面组织样本行芯片检测,筛选差异表达明显的微小RNA,经实时荧光定量RT-PCR验证后行京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路功能富集分析。对数据行配对样本t检验或两样本t检验。结果(1)伤后3 d,2组创面面积均明显缩小,肉芽组织增生明显。伤后7 d,2组创面均进一步缩小,创腔基本被肉芽组织填平;A组创面缩小更明显,肉芽组织量多。伤后14 d,A组创面基本愈合;B组部分创面仍存在少许创腔及结痂。伤后3、7 d,A组创面愈合率分别为(41±5)%和(75±4)%,明显高于B组的(31±9)%和(71±4)%(t值分别为10.13、8.06,P值均小于0.001)。(2)伤后3 d,2组创面表皮细胞、内皮细胞、Fb均排列稀疏,炎性细胞大量浸润。其中A组创面上述表现优于B组.伤后7 d,A组创面表皮细胞、内皮细胞、Fb排列渐致密,炎性细胞浸润稍多于B组。伤后14 d,A组表皮完全覆盖创面,B组部分创面仍有炎性浸润。(3)伤后3、7、14 d,A组创面CD31和PCNA阳性表达(0.275±0.018、0.345±0.034、0.305±0.023,0.406±0.063、0.223±0.011、0.045±0.022)均较B组(0.222±0.020、0.229±0.018、0.197±0.015,0.324±0.039、0.162±0.012、0.018±0.020)明显(t值为2.2819.652,P<0.05或P<0.01)。(4)微小RNA芯片检测筛选,与B组比较,A组创面组织中上调的微小RNA有18个、下调的有13个。(5)实时荧光定量RT-PCR的验证结果与芯片检测结果较一致。(6)KEGG信号通路功能富集分析显示31个差异表达明屁的微小RNA中有4个参与MAPK信号途径,3个参与Wnt信号途径,1个参与TGF-β信号途径,3个参与表皮生长因子受体信号途径,2个参与细胞周期途径,5个参与轴突导向信号途径,6个参与黏着斑途径,3个参与肌动蛋白细胞骨架途径,1个参与细胞外基质受体途径,3个参与黏着连接途径,1个参与细胞黏附分子途径。经揭盲,A组采用红色标签药剂为rhGM-CSF凝胶、B组采用蓝色标签药剂为凝胶基质。结论 rhGM-CSF凝胶可促进糖尿病大鼠创面愈合,引起皮肤组织中微小RNA明显差异性表达,这可能是其促进创面愈合在基因转录后水平上的靶点。
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