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摘要
【目的】通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase, T7 RNAP)的慢病毒系统，构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号：NZ＿CP081489.1)设计引物，并采用PCR扩增T7 RNAP基因片段，将其克隆至慢病毒载体中，构建pCDH-CMV-T7 RNAP重组质粒。筛选阳性克隆及测序鉴定后，利用脂质体将包含重组质粒pCDH-CMV-T7 RNAP的包装系统和辅助包装质粒共转染至HEK-293T细胞，进行慢病毒的包装及纯化，获得高病毒滴度的重组慢病毒。将收集的病毒液分别以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1、5、10和20感染BHK-21细胞，72 h后观察荧光情况，筛选最佳MOI。将重组慢病毒在最佳MOI条件下感染BHK-21细胞，通过绿色荧光蛋白copGFP的表达观察感染细胞的阳性率。使用4μg/mL嘌呤霉素作为抗性筛选物进行多轮筛选，最终筛选得到BHK-21-T7 RNAP细胞株。进一步对所筛选的细胞株设计3对检测引物进行RT-PCR检测，并通过检测试验组与空白对照组细胞中海肾荧光素酶(hRluc)报告基因的活性差异来反映T7 RNAP驱动T7启动子下游基因的能力。【结果】本研究成功扩增了大肠杆菌BL21(DE3)细胞基因组中T7 RNAP基因，成功构建重组慢病毒载体，并获得了滴度为1.0×108 TU/mL的重组慢病毒。成功筛选到BHK-21-T7 RNAP细胞株，此重组细胞株经RT-PCR扩增能够检测到T7 RNAP的特异性DNA序列。将含有T7启动子驱动的hRluc的质粒(pT7-hRluc)转染此细胞株后发现，BHK-21-T7 RNAP细胞株中hRluc的活力与空白对照组BHK-21细胞相比极显著升高(P<0.01)。【结论】本研究获得了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株，且所筛选的BHK-21-T7 RNAP细胞株中的T7 RNAP能够驱动pT7启动子下游基因hRluc的转录，研究结果为RNA病毒的反向遗传学平台建立奠定了细胞基础。
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