畸形表皮自调节因子1相关功能蛋白的筛选

作者：伍仙凤; 盛德乔

来源：细胞与分子免疫学杂志, 2015, 31(08): 1071-1080.

DOI：10.13423/j.cnki.cjcmi.007488

• DEAF1
• 稳定表达
• 免疫共沉淀
• 质谱分析
• 筛选

目的获得畸形表皮自调节因子1(DEAF1)稳定高表达的HEK293T细胞株,通过免疫共沉淀(Co-IP)和质谱分析技术筛选能与DEAF1相互作用的蛋白质因子。方法用Turbo Fect转染试剂将p EGFP-m DEAF1和p EGFP-N1质粒分别转染HEK293T细胞和2F-2B细胞、荧光显微镜观察DEAF1在2种细胞中的定位。将质粒p3×FLAG-m DEAF1分别转染HEK293T和2F-2B细胞株,同时设置相应未转染的空白对照组;通过反转录PCR法和实时定量PCR(qRT-PCR)检测DEAF1在2种细胞中mRNA表达水平,通过Western blot法检测DEAF1在2种细胞中蛋白表达水平。p3×FLAG-m DEAF1质粒转染HEK293T细胞,G418筛选阳性克隆,Western blot法、免疫荧光染色和流式细胞术鉴定DEAF1稳定表达的HEK293T-DEAF1细胞株。抽提HEK293T-DEAF1细胞和正常HEK293T细胞的核蛋白,用EZviewTMRed ANTI-FLAG M2亲和珠子进行Co-IP,SDS-PAGE分离,挑选明显富集和对照泳道没有的条带进行质谱分析,明确DEAF1的相关功能蛋白。结果荧光显微镜下可见DEAF1定位于细胞核;反转录PCR、qRT-PCR检测发现转染组DEAF1的mRNA表达水平明显高于未转染组;Western blot法检测发现转染组有融合蛋白m DEAF1-FLAG表达,成功获得稳定高表达DEAF1的HEK293T-DEAF1细胞。经Co-IP筛选和质谱分析,得到一些DEAF1的相关功能蛋白,如前mRNA处理所需的因子及酶,参与起始后RNA聚合酶,参与肽键断裂、蛋白空间结构形成的分子和其他转录因子等。结论成功获得稳定高表达DEAF1的HEK293T-DEAF1细胞,经Co-IP筛选和质谱分析获得了一些DEAF1相关的功能蛋白。

• 单位
  荆门市第二人民医院; 三峡大学