人源β-N-乙酰葡糖胺转移酶I(hGnT-I)的原核表达与活性鉴定

作者：陆天天; 王宁; 高晓冬^*

来源：食品与生物技术学报, 2021, 40(10): 56-62.

• β-N-乙酰葡糖胺转移酶I
• 大肠杆菌
• 重组表达
• 活性检测

N-乙酰葡糖胺转移酶I(hGnT-I)功能为在高尔基体中向糖蛋白上的N-寡糖M5GN2结构添加一个β-1,2连接的N-乙酰葡糖胺。为大量获得具有活性的hGnT-I蛋白,构建了重组表达质粒pET28a-MGAT1△TM并将其在大肠杆菌Rosetta菌株中表达。对诱导条件进行优化后,将获得的可溶性重组蛋白His-hGnT-I△TM进行镍柱亲和纯化并通过高效液相色谱(HPLC)检测其体外活性和底物特异性。结果表明,大肠杆菌ROSETTA体系可以成功表达可溶性重组hGnT-I蛋白;该蛋白质相对分子质量约为42800,在体外反应中具有相应的糖基转移酶活性;除天然糖链底物M5GN2外,该蛋白质可以识别非天然糖链底物M3GN2;产物经酶切反应验证,证明该蛋白质催化添加一个β糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺的反应。本研究所开发的原核表达体系可以大量制备纯化的功能性重组hGnT-I蛋白,以应用于该蛋白质的性质研究以及N-糖链的体外合成。

• 单位
  生物工程学院; 江南大学