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摘要
为建立猪圆环病毒2型(PCV2)的微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)检测方法,本研究针对PCV2ORF1基因设计引物和探针,经各反应条件的优化,确定反应体系中引物和探针终浓度分别为0.7μmol/L和0.25μmol/L,且退火温度为59℃时,ddPCR方法具有最佳的扩增效率(96%)。特异性试验结果显示,该ddPCR方法除了对PCV2检测结果为阳性外,对PCV1、PCV3和其它常见猪病病原的检测均未见阳性微滴,特异性较强。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品pUC57-NA-ORF1为模板,利用建立的PCV2 ddPCR检测技术进行敏感性试验,结果显示,ddPCR的最低检测限达2.93拷贝/μL,比荧光定量PCR(qPCR)高10倍以上,敏感性较高。批内和批间重复性试验结果显示,其变异系数均小于10%,重复性较好。利用建立的PCV2 ddPCR对24份猪组织样品和70份宠物饲料样品进行检测,结果显示,该ddPCR方法对猪淋巴结、脾、肺和肾脏等组织样品的检测结果与qPCR的检测结果一致,均检出10份阳性样品。但ddPCR对饲料样品的检测更为灵敏,共检出PCV2阳性样品14份,其中有5份样品的qPCR检测结果为阴性,表明本研究建立的ddPCR方法敏感性、抗干扰性和可靠性更高。本研究首次建立了PCV2 ddPCR检测方法,为饲料等复杂基质样品中PCV2的检测提供了有力技术手段。
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