抑制Claudin-3表达对体外培养鼠视网膜神经节细胞的作用研究

作者：曹迪; 张晓梅; 卢晶; 王肖; 刘入源; 刘秋慧; 罗燕; 吕林

来源：中华眼底病杂志, 2017, 33(02): 166-171.

• 视网膜神经节细胞/生理学
• 紧密连接蛋白质类
• RNA,小分子干扰
• 动物实验

目的观察腺相关病毒(AAV)介导小发夹RNA(sh RNA)干扰抑制Claudin-3表达对体外培养小鼠视网膜神经节细胞(RGC)的影响。方法原代培养小鼠RGC分为正常对照组、AAV-sh Scramble组、AAV-sh Claudin3组。细胞接种24 h后,AAV-sh Scramble组、AAV-sh Claudin3组RGC分别转染AAVsh Scramble和AAV-sh Claudin3。转染96 h后,活细胞荧光动态显微镜观察目的病毒转染效率;β-微管蛋白免疫荧光染色检测RGC轴突长度;免疫荧光4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色观察RGC凋亡形态;实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组RGC Claudin-3、血管内皮生长因子(VEGF)m RNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组RGC Claudin-3、VEGF、B淋巴细胞瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平。结果活细胞动态荧光显微镜观察发现,AAV-sh Scramble组、AAVsh Claudin3组RGC病毒转染效率均>50%;病毒转染96 h后,AAV-sh Claudin3组RGC轴突长度明显低于正常对照组、AAV-sh Scramble组,差异有统计学意义(F=2 363.274,P<0.05);AAV-sh Claudin3组RGC密度较正常对照组、AAV-sh Scramble组明显减低,可见细胞核皱缩、趋边以及细胞核裂解形成的凋亡小体。AAVsh Claudin组RGC的Claudin-3、VEGF m RNA表达明显低于正常对照组和AAV-sh Scramble组,差异有统计学意义(F=257.408、160.533,P<0.05)。AAV-sh Claudin3组RGC的Claudin-3、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显低于正常对照组和AAV-sh Scramble组,差异有统计学意义(F=129.671、420.552、62.669,P<0.05);Caspase-3蛋白表达明显高于正常对照组、AAV-sh Scramble组,差异有统计学意义(F=231.348,P<0.05)。结论 AAV介导sh RNA干扰抑制Claudin-3的表达可下调VEGF、Bcl-2及上调Caspase-3的表达,促进RGC凋亡,抑制RGC轴突生长。

• 单位
  眼科学国家重点实验室; 中山大学中山眼科中心