基于CRISPR/Cas9技术验证人T淋巴细胞中单等位突变型UNC13D基因脱颗粒功能

作者：蔡丽莎; 邢源; 黄佩; 陈艳^*; 徐晓军^*

来源：遵义医科大学学报, 2023, 46(11): 1058-1066.

DOI：10.14169/j.cnki.zunyixuebao.2023.0160

• CRISPR/Cas9系统
• 家族性噬血细胞综合征
• 基因编辑
• UNC13D基因
• T淋巴细胞

目的 利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除人T淋巴细胞中编码Munc13-4蛋白的UNC13D基因；并探讨突变型UNC13D基因(c.1232 G>A, p.R411Q)对人T淋巴细胞Munc13-4蛋白和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)脱颗粒功能的影响。方法 设计靶向敲除UNC13D基因的sgRNA序列，构建CRISPR/Cas9 UNC13D-sgRNA共表达质粒，筛选出切割效率较高的sgRNA通过第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染人T淋巴细胞，再将已包装好的野生型以及突变型UNC13D慢病毒感染knockout-UNC13D基因的人T淋巴细胞，以此分为野生型与突变型两组，应用流式细胞术检测两组间的Munc13-4蛋白表达、CTL的脱颗粒功能。结果 成功构建出CRISPR/Cas9 UNC13D-sgRNA共表达质粒，CRISPR/Cas9系统成功下调人T淋巴细胞Munc13-4蛋白表达水平；突变型UNC13D基因(c.1232 G>A, p.R411Q)编码的蛋白能够使人CTL脱颗粒功能下降。结论 CRISPR/Cas9基因编辑系统成功敲除人T淋巴细胞UNC13D基因，突变型UNC13D基因(c.1232 G>A, p.R411Q)可能为家族性噬血细胞综合征(FHL)的致病性突变位点。

• 单位
  浙江大学医学院附属儿童医院; 遵义医科大学