miR-146a-3p靶向TLR4减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤

作者：徐晓荣^*; 王海滨; 白晓月; 苏新云; 郭冉

来源：中国呼吸与危重监护杂志, 2021, 20(07): 495-502.

• 急性肺损伤
• miR-146a-3p
• Toll样受体4
• 炎症反应

目的研究微小RNA(miR)-146a-3p对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)和炎症反应的作用及机制。方法将32只BALB/c小鼠随机分为假手术组、ALI组、ALI+agomiR-阴性对照(NC)组以及ALI+miR-146a-3p激动剂组(ALI+agomiR-146a-3p组),每组8只。通过气管将5 mg/kg LPS滴入肺中以建立ALI模型,假手术组缓慢滴注等量生理盐水。ALI+agomiR-146a-3p组/NC组小鼠尾静脉注射8 mg/kg agomiR-146a-3p或agomiR-NC,1次/d,持续3 d。假手术组和模型组给予尾静脉注射等量生理盐水。24 h后处死并收集肺组织。RT-qPCR检测肺组织中miR-146a-3p和Toll样受体4(TLR4)mRNA的表达,蛋白印迹检测肺组织中TLR4、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白的表达水平,苏木精–伊红染色观察肺组织病理变化,原位末端转移酶标记法检测肺组织细胞凋亡情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺组织白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平。双荧光素酶报告系统验证MRC-5细胞中miR-146a-3p和TLR4的靶向关系。将人正常肺细胞MRC-5分为对照组、LPS组、LPS+miR-146a-3p mimic组、LPS+pcDNA3.1(pc)-TLR4组、LPS+miR-146a-3p mimic+pc-TLR4组。将100 nmol/L的miR-146a-3p mimic、pc-TLR4质粒分别或联合转染进入MRC-5细胞24 h后,用1 000 ng/mL的LPS或生理盐水处理72 h。流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白印迹检测TLR4、活化的caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达水平,ELISA检测IL-1β、IL-6和TNF-α水平。结果与ALI组相比,ALI+agomiR-146a-3p组小鼠肺组织中miR-146a-3p表达上调,而TLR4mRNA和蛋白表达均下调,肺组织细胞凋亡率减少,活化的caspase-3和Bax蛋白表达下调,而Bcl-2蛋白表达上调,肺组织中TNF-α、IL-6和IL-1β含量减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实miR-146a-3p通过靶向TLR4 3’UTR序列调控其转录(P<0.05)。与LPS组相比,LPS+miR-146a-3p mimic组MRC-5细胞中TLR4蛋白表达下调,细胞凋亡减少,活化的caspase-3和Bax蛋白表达下调,TNF-α、IL-6和IL-1β含量减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。过表达TLR4可逆转miR-146a-3p mimic过表达对LPS诱导的MRC-5细胞凋亡和炎症反应的作用(P<0.05)。结论 miR-146a-3p通过靶向下调TLR4缓解LPS诱导的小鼠ALI。