莱姆病螺旋体端粒解离酶的表达纯化及其晶体衍射分析

作者：胡元森; 王远; 吕扬勇; 黄亮; 张帅兵; 李娜^*

来源：西北农林科技大学学报(自然科学版), 2024, (02): 1-11.

DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2024.02.001

• 莱姆病螺旋体
• 端粒解离酶
• 原核表达和纯化
• 蛋白结晶
• X-射线衍射

[目的]对莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)端粒解离酶(telomere resolvase,ResT)进行原核可溶性表达纯化,并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体,为探究ResT-DNA复合物的结构和功能奠定基础。[方法]合成pET28b-ResT表达质粒,构建原核表达载体pSUMO-ResT,分析ResT可溶性蛋白在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21 Gold(DE3) pLysS、BL21 Codon Plus(DE3)、Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3) pLysS中的表达量,获得最优的ResT原核表达菌株。基于AlphaFold预测的ResT蛋白模型,利用定点突变及ResT可溶性蛋白表达分析,获得高效可溶性表达ResT突变体。经Ni-NTA亲和层析、HiTrap Heparin HP亲和层析及分子筛层析对ResT突变体ResT(W94H)进行蛋白纯化。利用EMAS检测ResT(W94H)与DNA的结合能力。使用蛋白晶体接种(seeding)和交叉接种(cross-seeding)方法,利用多种商业化结晶试剂盒筛选并优化ResT-DNA复合物的结晶条件,对复合物晶体进行X射线衍射分析。[结果] BL21 Gold(DE3) pLysS菌株是ResT最佳的高效可溶性表达菌株,W94H突变体比野生型具有更强的可溶性表达。获得了高纯度(95%)且高质量浓度(15 mg/mL)的ResT(W94H),其能够与底物DNA形成稳定的ResT-DNA复合物。在18℃下,ResT-DNA最佳结晶条件是:PEG3350 150 g/L、二甲苯二酸钠0.1 mol/L(pH 6.6)、NaCl 0.15 mol/L,ResT-DNA晶体分辨率最高为3.52 A,晶体空间群为P4。[结论]得到了高纯度ResT (W94H)蛋白,获得了ResT-DNA复合物晶体。

• 单位
  生物工程学院; 河南工业大学