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摘要
目的 表达环形泰勒虫的重组TA04380蛋白（r TA04380）并建立酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法，初步评价该方法的应用价值。方法 用TMHMM和SignalP对TA04380蛋白进行生物信息学分析，根据GenBank上公布的环形泰勒虫TA04380核苷酸序列设计引物，PCR扩增TA04380基因的截短片段（1～636 bp），构建pET30a (+)-TA04380表达质粒，转化至Rosetta (DE3)感受态细胞，诱导表达并纯化r TA04380蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定蛋白表达情况；蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析r TA04380蛋白的反应原性及其与其他牛梨形虫的交叉反应性。以r TA04380蛋白为靶抗原建立检测抗环形泰勒虫抗体的ELISA方法，筛选确定最佳的抗原包被量、血清和二抗的稀释度、孵育时间以及最优的封闭剂；用所建立的ELISA方法检测56份标准环形泰勒虫阴性牛血清和76份标准环形泰勒虫阳性牛血清以确定该检测方法的阈值；分析r TA04380蛋白包被后第1、 2、 3周ELISA方法的重复性和稳定性；用建立的ELISA检测125份牛血清，并与已报道的基于子孢子表面抗原（SPAG）蛋白的ELISA方法作比较，计算符合率；用建立的ELISA方法检测571份来自9个省（自治区）的牛血清，评价该方法的应用价值。结果生物信息学分析结果显示，环形泰勒虫TA04380蛋白无信号肽序列，在212～413 aa存在4次跨膜区，与东方泰勒虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为55%; PCR扩增片段长636 bp。SDS-PAGE结果显示，r TA04380蛋白主要以包涵体的形式存在，纯化后的r TA04380蛋白相对分子质量（Mr）为31 940; Western blotting分析结果显示，r TA04380蛋白能与抗His的单克隆抗体和环形泰勒虫阳性牛血清反应，与东方泰勒虫、中华泰勒虫、双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫阳性牛血清和健康牛血清无交叉反应。以r TA04380蛋白为抗原建立的ELISA方法，最佳反应条件为：抗原包被浓度为10μg/ml,1%牛血清白蛋白封闭1 h, 1∶100稀释的血清孵育1 h, 1∶6 000稀释的兔抗牛HRP-IgG孵育1 h；检测阈值为16.9%，敏感性和特异性分别为93.4%和96.4%，假阳性率为3.6%。用所建立的ELISA方法与基于SPAG蛋白的ELISA方法检测牛血清样品的阳性率分别是54.4%(68/125)和49.6%(62/125)，符合率为85.6%。用所建立的ELISA方法检测来自9个省（自治区）的571份牛血清样品，总阳性率为43.1%(246/571)，其中阳性率由高到低依次为吉林（85.7%, 24/28）、宁夏（54.2%, 13/24）、贵州（50.0%, 13/26）、河南（8/16）、甘肃（43.8%,57/130）、内蒙古（42.2%, 35/83）、辽宁（41.1%, 30/73）、云南（38.2%, 42/110）和青海（29.6%, 24/81）。结论 成功表达了r TA04380蛋白，建立的ELISA方法敏感性、特异性高，稳定性和符合性良好，具有大规模现场应用的潜在价值。
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单位家畜疫病病原生物学国家重点实验室; 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心; 中国农业科学院兰州兽医研究所
