E4F1真核表达载体的构建及与p53的相互作用

作者：廉攀峰; 程龙; 关鑫; 邹大阳; 梅玲; 沈媛; 任伟; 张菊会; 叶棋浓; 王恩群

来源：军事医学, 2014, 38(01): 53-56.

• E4F1
• p53
• 蛋白相互作用

目的构建E4F1野生型及缺失3281位氨基酸的真核表达载体,检测其与p53的相互作用及对下游基因p53的调节。方法分别用普通PCR和重组PCR方法从乳腺文库中扩增E4F1野生型编码序列及缺失3281位氨基酸的突变型序列,分别将其以正确相位构建到pXJ40-MYC载体中,得到重组质粒MYC-E4F1和MYC-E4F1(Δ32-81),分别转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经酶切鉴定并转染293T细胞,Western印迹检测蛋白的表达。将MYC-E4F1和MYC-E4F1(Δ32-81)质粒与FLAG-p53质粒共转染293T细胞,免疫共沉淀实验检测其相互作用,野生型及缺失突变型表达载体共转染骨肉瘤细胞U2OS,检测其对下游基因p53的调节。结果 E4F1重组质粒及其突变型构建成功,在293T细胞中鉴定表达正确,野生型及突变型E4F1均与p53存在相互作用,突变型的结合能力增强,野生型E4F1升高p21蛋白表达水平,而突变型不改变p21蛋白水平。结论成功构建E4F1野生型及缺失3281位氨基酸的突变型真核表达载体,二者都能与p53相互作用且突变型结合能力更强,野生型E4F1升高基因p53的靶基因p21的蛋白表达水平,而突变型不改变靶基因p21的蛋白水平。该研究为进一步研究E4F1对p53的调节及其机制奠定了基础。

• 单位
  安庆市立医院; 军事医学科学院; 安徽医科大学