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摘要
目的探索犬尿氨酸代谢通路对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSC)成骨分化的影响, 为研究牙周炎微环境对牙周组织再生的影响提供依据。方法于2022年6至10月在南京大学医学院附属口腔医院牙周病科、口腔综合科收集19例牙周炎患者(牙周炎组)和19例牙周健康者(牙周健康组)的非刺激性唾液, 采用超高效液相色谱-串联质谱检测两组受试者唾液中犬尿氨酸及其代谢产物的含量。对牙周炎组和牙周健康组的牙龈组织通过免疫组化检测吲哚胺2, 3-双加氧酶(indoleamine 2, 3-dioxygenase, IDO)与芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor, AhR)的表达情况。收集因正畸治疗需要拔除的前磨牙5颗(来自2022年7至11月南京大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科12～18岁的5例就诊患者), 从离体牙上提取PDLSC, 使用成骨诱导分化培养基(对照组)或含有20 μmol/L犬尿氨酸的成骨诱导分化培养基(犬尿氨酸组)培养7 d, 对成骨诱导的PDLSC进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色和ALP活性测定。通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)检测对照组和犬尿氨酸组PDLSC成骨相关基因ALP、骨钙素、runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2, RUNX2)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen type-Ⅰ, COL-Ⅰ)mRNA表达和犬尿氨酸通路相关基因AhR、细胞色素P450家族成员(cytochrome P450 family, CYP)1A1、1B1 mRNA的表达。通过蛋白质印迹法检测对照组和犬尿氨酸组RUNX2、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)和AhR蛋白表达情况。培养21 d时, 用茜素红染色评估对照组和犬尿氨酸组PDLSC矿化情况。结果牙周炎组唾液中犬尿氨酸[8.26(0, 19.60)nmol/L]及犬尿喹啉酸[11.4(3.34, 13.52)nmol/L]含量均显著高于牙周健康组[分别为0.75(0, 4.25)、1.92(1.34, 3.88)nmol/L](Z=-2.84, P=0.004;Z=-3.61, P<0.001)。牙周炎组牙龈组织中IDO(18.33±2.22)和AhR的表达(44.14±13.63)均显著高于牙周健康组(分别为12.21±2.87、15.39±5.14)(t=3.38, P=0.015;t=3.42, P=0.027)。ALP活性测定显示, 与对照组(329.30±19.29)相比, 犬尿氨酸组PDLSC ALP活性(291.90±2.35)显著下降(t=3.34, P=0.029)。RT-qPCR结果显示, 犬尿氨酸组PDLSC ALP、骨钙素和RUNX2表达(0.43±0.12、0.78±0.09、0.66±0.10)均较对照组(1.02±0.22、1.00±0.11、1.00±0.01)显著下降(t=4.71, P=0.003;t=3.23, P=0.018;t=6.73, P<0.001), AhR、CYP1A1 mRNA表达(1.43±0.07、1.65±0.10)均较对照组(1.01±0.12、1.01±0.14)显著升高(t=5.23, P=0.006;t=6.59, P<0.001), 两组间COL-Ⅰ、CYP1B1 mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。蛋白质印迹法结果显示, 犬尿氨酸组OPN、RUNX2表达(0.82±0.05、0.87±0.03)与对照组(1.00±0.00、1.00±0.00)相比均显著下降(t=6.79, P=0.003;t=7.95, P=0.001), AhR表达(1.24±0.14)显著高于对照组(1.00±0.00)(t=3.04, P=0.039)。结论牙周炎患者犬尿氨酸通路异常激活, 不仅能上调AhR相关通路, 还能抑制PDLSC的成骨向分化。
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单位南京大学; 南京市口腔医院
