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摘要
目的:探讨川芎嗪对人骨关节炎软骨细胞的影响及其作用机制。方法:收集接受膝关节置换术患者的膝关节软骨组织,分离并培养软骨细胞,采用肿瘤坏死因子-α诱导建立骨关节炎软骨细胞模型;将骨关节炎软骨细胞随机分为对照组和川芎嗪低、中、高浓度组,对照组加入正常培养基进行培养,川芎嗪低、中、高浓度组分别加入含川芎嗪浓度为25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1的培养基进行培养。培养24 h后,分别采用异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V/碘化丙啶双染色法和MTT法测定软骨细胞的凋亡率和活力,分别采用实时定量PCR和蛋白印迹法分析软骨细胞凋亡相关基因硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)-2、凋亡信号调节激酶(apoptosis signal regulating kinase, ASK)-1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease, Caspase)-3的mRNA和蛋白表达。结果:(1)软骨细胞培养结果。原代细胞培养至第15天,可见组织块周围有细胞成簇生长,细胞呈梭形、三角形或多角形;第3代软骨细胞多呈长梭形。(2)软骨细胞鉴定结果。甲苯胺蓝染色显示,细胞呈长梭形,有1～3个细胞核,细胞质呈蓝色;免疫组化染色显示,细胞Ⅱ型胶原蛋白呈阳性,细胞质内可见黄色颗粒,细胞核无着色,表明为软骨细胞。(3)软骨细胞凋亡率测定结果。4组软骨细胞凋亡率比较,差异有统计学意义[(25.10±0.47)%,(22.08±0.25)%,(19.37±0.36)%,(16.05±0.58)%,F=13.776,P=0.000]。川芎嗪低、中、高浓度组软骨细胞凋亡率均低于对照组(LSD-t=12.685,P=0.000;LSD-t=21.642,P=0.000;LSD-t=27.107,P=0.000),川芎嗪中、高浓度组软骨细胞凋亡率均低于川芎嗪低浓度组(LSD-t=13.826,P=0.000;LSD-t=21.349,P=0.000),川芎嗪高浓度组软骨细胞凋亡率低于川芎嗪中浓度组(LSD-t=10.875,P=0.000)。(4)软骨细胞活力测定结果。4组软骨细胞活力比较,差异有统计学意义(吸光度值:0.25±0.04,0.41±0.02,0.54±0.02,0.60±0.01,F=131.875,P=0.000),川芎嗪低、中、高浓度组软骨细胞活力均高于对照组(LSD-t=8.000,P=0.000;LSD-t=14.500,P=0.000;LSD-t=18.981,P=0.000),川芎嗪中、高浓度组软骨细胞活力均高于川芎嗪低浓度组(LSD-t=10.277,P=0.000;LSD-t=19.000,P=0.000),川芎嗪高浓度组软骨细胞活力高于川芎嗪中浓度组(LSD-t=6.000,P=0.000)。(5)软骨细胞凋亡相关基因mRNA和蛋白表达分析结果。4组软骨细胞Trx-2、ASK-1及Caspase-3的mRNA和蛋白相对表达量比较,组间差异均有统计学意义。川芎嗪低、中、高浓度组软骨细胞Trx-2的mRNA和蛋白相对表达量均高于对照组(mRNA:LSD-t=6.925,P=0.000;LSD-t=15.581,P=0.000;LSD-t=16.046,P=0.000;蛋白:LSD-t=2.479,P=0.000;LSD-t=23.000,P=0.000;LSD-t=33.988,P=0.000),川芎嗪中、高浓度组软骨细胞Trx-2的mRNA和蛋白相对表达量均高于川芎嗪低浓度组(mRNA:LSD-t=7.044,P=0.000;LSD-t=9.581,P=0.000;蛋白:LSD-t=6.149,P=0.000;LSD-t=15.321,P=0.000),川芎嗪高浓度组软骨细胞Trx-2的mRNA和蛋白相对表达量均高于川芎嗪中浓度组(LSD-t=3.994,P=0.004;LSD-t=18.605,P=0.000);川芎嗪低、中、高浓度组软骨细胞ASK-1和Caspase-3的mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组(mRNA:LSD-t=8.808,P=0.000;LSD-t=10.398,P=0.000;LSD-t=19.350,P=0.000;LSD-t=3.796,P=0.000;LSD-t=5.096,P=0.000;LSD-t=10.028,P=0.000;蛋白:LSD-t=5.041,P=0.001;LSD-t=13.466,P=0.000;LSD-t=21.719,P=0.000;LSD-t=2.481,P=0.038;LSD-t=7.286,P=0.001;LSD-t=16.865,P=0.000),川芎嗪中、高浓度组软骨细胞ASK-1和Caspase-3的mRNA和蛋白相对表达量均低于川芎嗪低浓度组(mRNA:LSD-t=3.385,P=0.000;LSD-t=20.466,P=0.000;LSD-t=3.400,P=0.000;LSD-t=9.701,P=0.000;蛋白:LSD-t=8.296,P=0.000;LSD-t=17.303,P=0.000;LSD-t=6.228,P=0.000;LSD-t=17.365,P=0.000),川芎嗪高浓度组软骨细胞ASK-1和Caspase-3的mRNA和蛋白相对表达量均低于川芎嗪中浓度组(mRNA:LSD-t=9.550,P=0.005;LSD-t=3.619,P=0.007;蛋白:LSD-t=14.017,P=0.005;LSD-t=4.985,P=0.001)。结论:川芎嗪能够抑制人骨关节炎软骨细胞的凋亡,提高软骨细胞活力,且该作用在一定浓度范围内呈浓度依赖性;其作用机制可能与调控Trx-2/ASK-1/Caspase-3信号通路有关。
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