轮状病毒NSP5克隆、鉴定、表达及其条件优化

作者：林家锋; 陶晓莉; 陆恒章; 于美玲; 李婷婷; 李藤菲; 程美慧; 李永刚^*

来源：中国人兽共患病学报, 2021, 37(08): 703-708.

• 轮状病毒
• NSP5
• 基因重组
• 蛋白表达
• 蛋白纯化

目的为制备NSP5多克隆抗体及进一步研究NSP5的功能和在轮状病毒复制中的作用奠定基础。方法利用分子克隆的技术构建出原核表达蛋白质粒NSP5-pGEX-6P-1和真核表达质粒NSP5-pFLAG-CMV-3,其中NSP5-pFLAG-CMV-3转染细胞后通过Western Blot和间接免疫荧光法观测NSP5在293T细胞里的表达和定位;NSP5-pGEX-6P-1经转化E.coli BL21(DE3)后从IPTG浓度、温度及历经时间3个方面摸索出最优化的诱导蛋白表达条件,并经GST琼脂糖树脂纯化蛋白且用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定。结果构建了真核表达载体NSP5-pFLAG-CMV-3和原核表达载体NSP5-pGEX-6P-1。经NSP5-pFLAG-CMV-3转染后的293T细胞通过Western Blot验证NSP5蛋白在细胞中成功表达,间接免疫荧光观察到重组蛋白在细胞质中富集。37℃、8 h、0.4 mmol/L IPTG诱导是NSP5-pGEX-6P-1蛋白表达的最适条件,且以包涵体形式汇聚在沉淀中进行表达。SDS-PAGE和Western Blot表明重组蛋白纯化成功。结论成功构建NSP5重组表达系统,成功优化了NSP5蛋白诱导表达的条件并纯化蛋白。

• 单位
  基础医学院; 锦州医科大学