应用CRISPR/Cas9技术制备Sema4D基因条件性敲除小鼠模型

作者：伍晴; 罗银河^*; 王孟清; 马晓萌

来源：中医药信息, 2021, 38(08): 28-34.

DOI：10.19656/j.cnki.1002-2406.210804

• 基因敲除
• CRISPR/Cas9技术
• 神经免疫信号蛋白4D

目的:利用CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9)基因编辑技术使用C57BL/6J小鼠建立Sema4D基因条件性敲除小鼠模型,为Sema4D基因在哮喘中扮演的角色和作用机制的研究提供实验基础。方法:根据Sema4D基因第4外显子碱基序列,设计针对Sema4D基因的gRNA(guide RNA),构建gRNA表达质粒,将体外转录gRNA、Cas9 mRNA和含有loxP位点的供体载体对C57BL/6J小鼠的受精卵进行显微注射,产生目标基因敲除子代,待小鼠出生后1周左右剪小鼠脚趾进行PCR鉴定和序列分析,所获F0代founder小鼠继续与野生型小鼠合笼繁殖获取F1代小鼠,1周左右后剪取组织送检PCR。将F1靶向flox杂合小鼠与组织特异性Sftpc-CreERT2工具鼠杂交,生成F2代小鼠,该F2代小鼠对于目标等位基因是杂合的,而对于Cre转基因是阳性的。F2代自交扩繁后得到F3代的CKO(flox/flox,Sftpc-CreERT2)纯合子雄性小鼠和flox/+、flox/flox、flox/+Sftpc-CreERT2雌性小鼠交配后,得到F4代CKO小鼠。再经他莫昔芬的诱导敲除目标条件基因后,qPCR检测mSema4D的含量确认目标基因是否敲除成功。结果:获得F4代CKO敲除小鼠,qPCR结果显示经他莫昔芬诱导后获得正确的Sema4D基因条件性敲除小鼠模型。结论:成功建立C57BL/6J小鼠Sema4D条件性敲除模型,为研究Sema4D表达缺失与哮喘气道免疫炎症的相关性提供了重要工具。

• 单位
  湖南中医药大学第一附属医院; 湖南中医药大学