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摘要
【目的】研究菠萝叶基原生质体的高效分离方法，并对制备的原生质体进行瞬时转化，为利用菠萝原生质体进行菠萝基因功能研究提供技术支持。【方法】以‘巴厘’菠萝（Ananas comosus,‘Comtede Paris’）幼嫩叶片的叶基为材料，采用3因素3水平正交试验L9（3～3）分析纤维素酶质量浓度（6,12,20 g/L）、离析酶质量浓度（3,6,9 g/L）和甘露醇浓度（0.4,0.5,0.6 mol/L）对分离原生质体产量与活力的影响；同时，利用单因素试验（设置酶解时间2,4,6 h）筛选制备原生质体的最适酶解时间，确定分离菠萝叶基原生质体的最适条件；在最适条件下制备原生质体，采用聚乙二醇（PEG）介导法转化质粒，建立菠萝原生质体瞬时转化体系。【结果】L9（3～3）正交试验结果显示，不同处理分离的原生质体产量为1.01×10～6～1.93×10～6 g-1,纤维素酶质量浓度是决定原生质体产量的关键因素；原生质体活力为65.55%～87.00%,甘露醇浓度对原生质体活力的贡献最大。最适酶解条件为：菠萝叶基在含12 g/L纤维素酶、6 g/L离析酶、0.6 mol/L甘露醇的酶液中避光酶解4 h,产量可达1.96×10～6 g-1,活力为85.54%。菠萝叶基原生质体通过PEG介导法转化pAN580-WRKY75质粒后，可在激光共聚焦显微镜下观察到核内的绿色荧光信号。【结论】确定了菠萝叶基原生质体的最适分离条件与瞬时转化方法，建立了适用于菠萝基因功能分析的原生质体瞬时表达体系。
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