科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
【目的】Dam H是一种具有酯酶活性的酰胺水解酶,其非活性中心氨基酸残基的突变对重组酶可溶性表达和比酶活产生一定的影响。拟探索Dam H的活性中心氨基酸残基构成,并对其非活性中心氨基酸残基突变对可溶性表达和比酶活的影响进行研究。【方法】通过重叠延伸的方法对Dam H可能的活性中心氨基酸S149、E244和H274以及非活性中心氨基酸D165及N192进行定点突变,通过静息细胞测活验证了S149、E244和H274在催化2-氯-N-(2’-甲基-6’-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)水解反应中的作用,通过Ni2+-NTA亲和层析对D165及N192突变子进行纯化,对突变株和野生型比酶活进行比较。【结果】研究表明S149A使Dam H的CMEPA水解酶活性下降为野生型的5%,E244A和H274A突变导致其失去活性;D165P和N192P突变影响到Dam H的可溶性表达,表达量分别为野生型的28.2%和20.8%,突变子N192P、D165P比酶活分别为野生型比酶活的55.5%和49.7%。【结论】Dam H催化酯类底物和芳基酰胺类底物可能共用同一活性中心S149、E244和H274,其两个α螺旋的转角处氨基酸侧链极性和刚性结构的改变对可溶性表达以及活性有很大的影响。
- 单位
