葛根抑制高糖诱导巨噬细胞损伤与调控内质网应激信号通路的关系探讨

作者：容子玲; 刘玉晖^*; 朱洪杨; 李玉婷; 刘荣华

来源：中国实验方剂学杂志, 2022, 28(24): 58-64.

DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20221702

• RAW264.7巨噬细胞
• 细胞损伤
• 葛根
• 高糖
• 内质网应激

目的：观察葛根含药血清对高糖诱导的重度内质网应激(ERS)模型中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、内质网应激信号通路蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、活化转录因子4(ATF4)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)的作用，观察葛根对高糖诱导巨噬细胞炎症损伤的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：采用血清药理学方法，制备空白血清和葛根含药血清，体外培养RAW264.7巨噬细胞，采过62.5 mmol·L-1葡萄糖诱导巨噬细胞建立体外重度ERS模型，使用不同体积分数的葛根含药血清及内质网应激抑制剂(4-PBA)干预细胞。通过细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测不同葡萄糖浓度(22.5、23.5、25.0、27.5、32.5、47.5、72.5、122.5 mmol·L-1)及不同体积分数葛根含药血清(0%、2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%)对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响；在CCK-8法检测葡萄糖浓度对巨噬细胞存活率影响结果基础上采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同葡萄糖浓度浓度(22.5、32.5、42.5、52.5、62.5、72.5 mmol·L-1)及不同时间段下(6、12、24、36、48 h)ERS的标志性蛋白GRP78的表达量，筛选出建立重度ERS模型最适造模浓度和时间，基于上述实验结果将细胞分为分别将细胞分为空白组、62.5 mmol·L-1葡萄糖模型组、2 mmol·L-14-PBA组、高、中、低(15%、10%、5%)葛根含药血清组开展后续实验，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测重度ERS模型中RAW264.7巨噬细胞上清液中TNF-α的表达，Western blot检测重度ERS模型中相关通路蛋白表达情况。结果：CCK-8法检测发现，在葡萄糖浓度为27.5 mmol·L-1刺激下巨噬细胞存活率达到最高(P<0.01)、而在葡萄糖浓度22.5～27.5 mmol·L-1刺激下，巨噬细胞存活率随浓度增加而呈上升趋势，葡萄糖浓度在25.0 mmol·L-1时差异有统计学意义(P<0.01)，在葡萄糖浓度37.5～122.5 mmol·L-1刺激下，则出现了下降趋势，葛根含药血清在1%～15%皆差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),Western blot法检测不同葡萄糖浓度和不同时间段下的GRP78蛋白表达量发现，在24 h时，GRP78蛋白表达显著性最强(P<0.01)，葡萄糖浓度为62.5 mmol·L-1时，GRP78蛋白表达量最强(P<0.01)；由此可知葡萄糖浓度为62.5 mmol·L-1可作为诱导重度ERS模型的最适浓度。与空白组相比较，模型组中TNF-α、GRP78、ATF4蛋白表达水平，磷酸化(p)-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α明显升高(P<0.05,P<0.01)，而与模型组比较，各给药组的TNF-α、GRP78、ATF4蛋白表达水平，p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论：在体外实验结果表明，葛根在一定程度上可缓解高糖诱导巨噬细胞所出现的炎症损伤及通过抑制ERS信号通路中GRP78、ATF4、PERK、eIF2α的表达，以此来恢复细胞稳态。

• 单位
  江西中医药大学药学院