miR-302d的载体构建及其与Tle4基因的靶向关系验证

作者：吴宇慧; 席一凡; 张文慧; 程富富; 胡菜; 赵宗仪; 陈欣雨; 李熠; 张亚妮^*

来源：中国家禽, 2023, 45(02): 20-26.

DOI：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.02.004

• miR-302d
• Tle4
• 双荧光素酶报告检测

试验旨在探究精原干细胞（SSCs）形成过程中的关键miR-302d行使功能的分子机制。试验克隆mi R-302d前体序列并连入PGMLV-CMV-MCS-EF1-Zs Green1-T2A-Puro构建mi R-302d过表达载体（mi R-302d mimics）；合成mi R-302d的干扰靶点并连入PGMLV-SC5载体构建mi R-302d干扰载体（mi R-302d inhibitor）。通过生物信息预测获得mi R-302d靶基因并构建其3′UTR的野生型（WT）和突变型载体（MT）；将mi R-302d过表达载体分别与WT和MT载体共转染DF-1和293T细胞，检测靶基因3′UTR的活性。同时检测在DF-1细胞中过表达或干扰mi R-302d后靶基因的表达变化。结果显示：成功构建mi R-302d的过表达和干扰载体；预测结果显示Tle4为mi R-302d的潜在靶基因，且该基因为ESCs分化为SSCs过程的重要基因；双荧光素酶活性检测结果显示不论是在DF-1还是293T细胞中，与转染WT+mi R-NC组相比，转染WT+mi R-302d组的双荧光素酶活性显著下降（P<0.05），而共转染MT+mi R-302d组的荧光素酶活性差异不显著（P>0.05），且过表达mi R-302d后下调Tle4的表达，而干扰mi R-302d后上调Tle4的表达。结果表明，miR-302d可直接调节靶基因Tle4的表达。

• 单位
  温州肯恩大学; 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室; 扬州大学