长链非编码RNA钾电压门控通道亚家族Q成员1重叠转录物1靶向调控miR-92a-1-5p影响胰岛β细胞功能的机制研究

作者：陈亚兰; 李晏丽; 林倍思; 麦晓东; 彭粤跃; 陈丹蕊; 苏燕娜; 徐芬; 李万根; 许雯^*

来源：中华糖尿病杂志, 2022, 14(05): 473-481.

DOI：10.3760/cma.j.cn115791-20211202-00642

• 糖尿病
• 胰岛素分泌
• 长链非编码RNA
• Kcnq1ot1
• miR-92a-1-5p

目的探讨长链非编码RNA 钾电压门控通道亚家族Q成员1重叠转录物1(Kcnq1ot1)通过调节miR-92a-1-5p影响胰岛β细胞胰岛素分泌的作用机制。方法自2020年6至12月在中山大学附属第三医院招募初诊2型糖尿病(T2DM)患者25例, 同时招募年龄匹配且无糖尿病的受试者21例作为对照组。收集受试者的年龄、体重指数(BMI), 检测空腹血糖(FPG)和糖化血红蛋白(HbA1c), 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清中Kcnq1ot1表达量, 并分析其与FPG和HbA1c的相关性。12只5周龄雄性C57BL/6J小鼠采用随机数字表法分为高脂饮食(HFD)组(n=6)和正常饮食(CD)组(n=6), 喂养20周后, 提取原代胰岛细胞RNA。将体外培养的Min6细胞分为牛血清白蛋白(BSA)组和棕榈酸(PA, 400 μmol/L)组;按照是否转染Kcnq1ot1 siRNA分为si-NC组和si-Kcnq1ot1组;按照是否转染miR-92a-1-5p的模拟物或抑制剂分为:模拟物对照组、模拟物组、抑制剂对照组和抑制剂组;按照转染Kcnq1ot1/NC siRNA后是否加入抑制剂分为si-NC+抑制剂对照组、si-Kcnq1ot1+抑制剂对照组、si-NC+抑制剂组和si-Kcnq1ot1+抑制剂组。采用qRT-PCR检测Kcnq1ot1、miR-92a-1-5p和胰岛素转录本1(Ins1)、胰岛素转录本2(Ins2)、胰岛素受体(Insr)、NK6同源盒蛋白1(Nkx6.1)、胰岛素受体底物1(Irs1)和神经生成素3(Ngn3)mRNA水平;Western blotting检测胰岛素和Insr蛋白表达水平;葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测胰岛素分泌水平;双荧光素酶报告基因实验验证Kcnq1ot1与miR-92a-1-5p之间的直接作用关系。各组间指标的差异比较采用独立样本t检验、方差分析, 采用Pearson相关分析法分析受试者Kcnq1ot1表达量与FPG和HbA1c的相关性。结果 T2DM患者血清中Kcnq1ot1的表达量较对照组显著下调(P<0.01), 且Kcnq1ot1的表达量与FPG和HbA1c呈负相关关系(r=-0.52、-0.49, 均P<0.05)。与CD组相比, HFD组小鼠胰岛中Kcnq1ot1表达量下调(P<0.001)。在Min6细胞中, 与BSA组相比, PA组细胞中Kcnq1ot1表达量下调(P<0.01);与si-NC组相比, si-Kcnq1ot1组葡萄糖刺激的胰岛素分泌降低(P<0.05), 且Ins1、Ins2、Insr、Nkx6.1、Irs1和Ngn3的mRNA水平及Insr和胰岛素的蛋白水平均降低(P<0.05);与模拟物对照组相比, 模拟物组葡萄糖刺激的胰岛素分泌降低(P<0.05), 且Ins1、Ins2、Insr、Nkx6.1、Irs1和Ngn3的mRNA水平及Insr和胰岛素的蛋白水平均降低(P<0.05);与抑制剂对照组相比, 抑制剂组葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平升高(P<0.05), 且Ins1、Ins2、Insr、Nkx6.1、Irs1和Ngn3的mRNA水平及Insr和胰岛素的蛋白水平均升高(P<0.05)。双荧光素酶报告实验显示, 模拟物和Kcnq1ot1-WT质粒共转染细胞后, Kcnq1ot1-WT荧光素酶活性降低(P<0.05);抑制剂和Kcnq1ot1-WT质粒共转染细胞后, Kcnq1ot1-WT的荧光素酶活性显著升高(P<0.05)。与si-NC组相比, si-Kcnq1ot1组miR-92a-1-5p表达升高(P<0.05);与si-Kcnq1ot1+抑制剂对照组相比, si-Kcnq1ot1+抑制剂组Min6细胞中的Ins1、Ins2、Insr、Irs1和Ngn3转录水平及胰岛素和Insr的蛋白水平升高(P<0.05)。结论长链非编码RNA Kcnq1ot1可能通过靶向调控miR-92a-1-5p影响胰岛β细胞功能。

• 单位
  中山大学附属第三医院; 广州医科大学附属第二医院