利用CRISPR/Cas9在人类黑色素瘤细胞中编辑MC1R与功能分析

作者：张充; 魏子璇; 王敏; 陈瑶生; 何祖勇^*

来源：遗传, 2022, 44(07): 581-590.

DOI：10.16288/j.yczz.22-037

• MC1R
• 基因定点突变
• CRISPR/Cas9
• A243T

MC1R(melanocortin 1 receptor)基因编码黑皮质素1型受体，它在配体α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)的刺激下，可促进细胞内c AMP (cyclic adenosine monophosaphate)的生成，从而激活PKA(protein kinase A system)信号通路，促进黑色素合成调控的关键转录因子–小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)，以及限速酶–酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)的表达，进而调控真黑素和褐黑素的合成，影响动物的毛色表型。有研究表明，杜洛克猪(Susscr of adomestica)MC1R蛋白第6个跨膜结构域(transmembrane domain 6, TM6)发生了A243T突变，该突变可能影响MC1R蛋白生物学功能，被认为是导致杜洛克猪红毛表型的主要因素，然而却一直未被验证过。因此，本研究以单链寡核苷酸(singlestranded oligo-deoxyribonucleotides, ss ODN)作为同源重组模板，利用CRISPR/Cas9技术在人类黑色素瘤细胞系SK-MEL-2中引入MC1R基因的c.727G>A (A243T)突变，以分析其对MC1R功能的影响。结果表明ss ODN发生同源重组的效率可达10%。通过对共转染ss ODN和CRISPR/Cas9表达载体的细胞进行筛选和培养，获得6个单克隆细胞株，进行测序鉴定，结果未能筛选到发生预期突变的单克隆细胞株，所有单克隆细胞株皆在目标位点周围出现突变。对转染后的细胞群进行功能分析，结果发现其c AMP信号强度、MITF基因和TYR基因表达量均显著低于未转染的细胞，表明编辑MC1R可影响细胞的黑色素合成功能。本研究为深入分析MC1R突变影响动物毛色提供了进一步的参考。

• 单位
  有害生物控制与资源利用国家重点实验室; 中山大学生命科学学院