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摘要
目的以人源A549细胞为研究对象,体外构建百草枯(Paraquat,PQ)细胞模型,探讨血小板反应蛋白(Thrombospondin, TSP)及其受体CD47在PQ致肺纤维化中的作用。方法体外培养人源A549细胞,实验分为正常组、PQ组、Anti-TSP1组(PQ+终浓度为10μg/ml的TSP1中和抗体)。采用CCK8法检测不同浓度PQ(50、100、200、400、600、800、1 000μmol/L)在不同时间(12、24、48 h)对细胞存活率的影响,以细胞半数存活率为标准筛选出作用于后续试验的浓度和时间点;倒置显微镜观察细胞形态变化;采用酶联免疫吸附(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)法测定纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)、I型胶原的表达量;免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)法观察TSP-1、CD47的蛋白表达情况;免疫荧光双染(Immunofluorescence double staining)观察TSP-1、CD47共表达;实时荧光定量PCR(Real Time PCR,RT-PCR)检测TSP-1、CD47 mRNA的表达量,Western印迹法(Western Blot,WB)检测TSP-1、CD47蛋白表达;流式细胞仪检测细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平。结果 PQ作用时间一定时,细胞活性随PQ浓度增加而降低。正常组细胞间连接紧密,呈鹅卵石状,排列整齐,岛状或成团生长;PQ组细胞随着PQ浓度增加,细胞间隙逐渐增大,形态逐渐变得不均一,伸出不规则突起,呈纺锤体形或长梭形。随着PQ作用浓度增加,与正常组比较,PQ组FN、I型胶原的相对表达量逐渐增多,差异有统计学意义(P<0.05),以200μmol/L时最为明显,差异有统计学意义(P<0.05)。随着PQ作用浓度增加,与正常组比较,PQ组TSP-1、CD47的mRNA水平表达上调、蛋白表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),以200μmol/L时最为明显。免疫荧光显示TSP-1、CD47在细胞质中存在共表达,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较,PQ组细胞ROS水平在24 h时明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与PQ组比较,Anti-TSP1组细胞活性明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),形态趋向正常细胞形态变化;TSP-1、CD47的RNA水平及蛋白表达量均有下降,差异有统计学意义(P<0.05);ROS的过表达受到抑制,差异有统计学意义(P<0.05); FN、I型胶原的相对表达量减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PQ刺激A549细胞可诱导细胞发生形态学改变,使TSP-1、CD47表达增加、FN、I型胶原的表达量升高、ROS产生增多。TSP-1中和抗体对抗TSP-1后,可部分改善以上变化。TSP-1-CD47可能与氧化应激介导的PQ致肺纤维化过程相关联。
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单位南充市中心医院; 第二临床学院; 川北医学院
